优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌

优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌

岳秀宏; 李祥宇; 刘鹏阳; 陆姝欢; 万霞

【期刊名称】《《中国油料作物学报》》

【年(卷),期】2019(041)005

【总页数】8页(P796-803)

【关键词】裂殖壶菌; 油脂含量; 尼罗红荧光染色

【作者】岳秀宏; 李祥宇; 刘鹏阳; 陆姝欢; 万霞

【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所湖北武汉 430062; 嘉必优生物技术股份有限公司湖北武汉 430073; 湖北大学生命科学学院湖北武汉 430062; 农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室湖北武汉 430062; 农业部油料加工重点实验室湖北武汉 430062

【正文语种】中文

【中图分类】TK6

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种重要的ω-3系列超长

链多不饱和脂肪酸，由22个碳和6个双键组成[1]。DHA广泛存在于人类的神经

和视网膜组织中，是神经系统细胞生长及维持的必要因素，也是大脑和视网膜的重要成分，对胎婴儿智力和视力发育至关重要[2]。研究报道表明DHA还具有降低高血压、心血管疾病、炎症和某些癌症的风险，因此受到人们越来越多的关注[3～5]。目前，除了鱼油来源的DHA外，裂殖壶菌、吾肯氏壶藻和寇氏隐甲藻等微生物也

被用于DHA的商业化生产，原卫生部2010年第3号公告将其列为新食品原料。其中,裂殖壶菌作为DHA产业化生产的菌株，以其生长速率和高效的产油效率成为DHA产业化生产的研究热点[6]。不同亚种间或不同发酵条件下，裂殖弧菌DHA 含量约占细胞总脂肪酸的23%～51%，DHA产量约为6～36 g/L[7]。中性脂为裂殖壶菌主要的油脂成分，占总油脂95.90%，其中以三酰甘油（TAG）为主，占中性油脂的97.20%[8]。通过提高TAG含量进一步提高裂殖壶菌DHA产量是目前研究报道的热点。由于基因工程和基因编辑改造方法和法规尚不完善，通过物理或化学手段诱变并筛选高产突变株，仍是提供优势菌株资源的重要手段。因此，建立快速、简便、高通量方法筛选高含油脂的突变株十分关键。

目前，微生物油脂定量的方法主要为有机试剂提取（称重法）[9]和气相色谱法[10]。但前者样品需求量大，操作繁琐，安全性低，后者虽灵敏度高，但设备及检测标品昂贵且耗时。这两种方法的检测通量均不高，因此应用于高含油脂的裂殖壶菌突变株的筛选时耗时耗力。尼罗红是一种脂溶性的荧光染料，可以与胞内油脂结合产生荧光。尼罗红与胞内油脂结合产生的荧光强度与胞内油脂含量呈正比，已被运用于酵母、微藻等多种微生物油脂含量的检测[11～14]。该方法操作简单、样品量小、可高通量操作，能较好地适用于微生物的油脂检测。

尽管尼罗红荧光染色法在快速检测高油脂含量微生物方面有较大优势，但将该方法应用于不同的物种还需要重新优化染色条件，且该方法仍有改进空间。不同物种的油脂成分有所差异，激发光与发射光也有所不同[14～18]。本文结合多功能酶标仪与荧光光谱仪，系统选择了适用于裂殖壶菌油脂含量检测的激发光与发射光。目前报道过的文献中[11～18]检测胞内油脂均用磷酸缓冲盐溶液（PBS）或无菌水对细胞进行洗涤，以消除培养基对染色的影响，但操作繁琐，在样品多的情况下耗时长，不适合高通量的菌株筛选工作。本实验在简化洗涤步骤的情况下，探究了尼罗红染色法应用于裂殖壶菌胞内油脂测定时最适宜的激发光与发射光波长、细胞溶

剂二甲基亚砜体积分数、尼罗红用量、染色时间及细胞密度等条件，试图建立简便、高通量、快速的方法检测裂殖壶菌油脂含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株：本实验所用菌株为裂殖壶菌Schizochytrium sp.A-2，由嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司提供。

材料：葡萄糖、谷氨酸钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾，均购于国药集团化学试剂有限公司。尼罗红(Nile red，NR)、二甲基亚砜(dimethyl slfoxide,DMSO)均购于美国Sigma Aldrich公司。

仪器：立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；电热恒温振荡培养箱（太仓市强乐实验设备有限公司）；干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）；多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；荧光光谱仪（日本日立公司）；电子精密天平(瑞士

梅特勒-托利多公司)；气相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养基及相关试剂的配置活化培养基：葡萄糖40 g，酵母浸膏6 g，天然海水1 L，pH 6.8，于121℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖50 g，酵母浸膏9 g，谷氨酸钠30 g，补加天然海水至1 L，pH 6.8，于121℃灭菌20 min。

PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.2 g/L、十二水合磷酸氢二钠2.9 g/L、氯化钠8.0 g/L，氯化钾0.2 g/L，pH 7.4，121℃灭菌15 min。

尼罗红染液：将1 mg尼罗红溶于10 mL的丙酮中，用有机滤膜过滤到小棕瓶中

避光保存。

1.2.2 菌种培养与发酵挑取平板保存的单菌落于装有30 mL活化培养基的250

mL锥形瓶中，28℃，150 r/min，培养48 h，活化两代。接种5%的种子液到装

有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，28℃，220 r/min，培养48 h。

1.2.3 油脂含量测定离心收集细胞，进行冷冻干燥后，通过脂肪酸提取及气相色谱分析方法[20]测定胞内油脂含量。

1.2.4 荧光强度的测定取500μL菌液加入500μL一定体积分数的DMSO振荡混匀，向其中加入一定体积的1 mg/mL的尼罗红染液，再次混匀于暗处染色。取200μL染色后重悬菌液于96孔黑色酶标板中，使用多功能酶标仪检测荧光强度，并扣除空白培养基尼罗红染色荧光强度值。

2 结果与分析

2.1 DMSO浓度、激发光及发射光对尼罗红染色荧光强度的影响

2.1.1 DMSO浓度对尼罗红染色荧光强度的影响DMSO是一种含硫的有机化合物，能改变细胞壁和细胞膜对药物、毒物、电解质等的透性，使尼罗红易于透过细胞壁与胞内油脂结合，提高染色效果。与丙酮、甲醇、异丙醇等相比，DMSO挥发性

较低，可与水以任意比例互溶，已广泛应用于微藻尼罗红染色法[12,15,18]。由于不同菌种的细胞壁通透性不同，DMSO的用量不同，相关研究中检测微拟球藻采

用的浓度为15%[17]，检测小球藻采用的浓度为20%[18]。因此本实验首先考察DMSO浓度对尼罗红染色荧光强度的影响，此部分实验条件为尼罗红浓度

1μg/mL，常温避光染色10 min，DMSO体积分数分别设为5%、10%、20%、30%、40%、50%。使用酶标仪设定激发光为480 nm，发射光在550～750 nm 范围内，每隔10 nm进行一次荧光值检测，结果如图1所示。

由图1A可知，在没有细胞的情况下，DMSO体积分数为30%～50%时染色液在650 nm处出现峰值，因此认为DMSO与尼罗红结合在650 nm处形成发射波。且DMSO浓度越高，尼罗红与DMSO结合峰值越高。由图1B可以看出，尼罗红与脂质结合，在580 nm左右产生峰值，DMSO浓度为20%时，尼罗红对油脂染色效果最佳；DMSO浓度为30%和40%时，尼罗红与DMSO结合，胞内油脂不

能充分地与尼罗红结合，峰值降低；尼罗红浓度为50%时，DMSO与尼罗红结合产生的荧光遮盖尼罗红对中性脂染色产生的荧光，峰值右移；DMSO浓度为10%和5%时，未看到显著峰值，DMSO浓度太低不足以改变细胞透性，尼罗红与脂

质结合不充分，荧光强度较低未形成显著特征峰。综上所述，DMSO浓度为20%时，其作为溶剂不会影响尼罗红与油脂结合，且该浓度尼罗红与油脂结合染色效果最佳。后续实验DMSO浓度均为20%。

2.1.2 激发光及发射光对尼罗红染色荧光强度的影响尼罗红与中性脂结合，激发光光谱范围在450～580 nm之间，发射光光谱范围在500～750 nm之间。不同物种的油脂种类不同，所选择的激发光与发射光也会有差异。文献[14]中四株小球藻油脂含量检测激发光直接设为480 nm，发射光为575 nm。文献[15]中裂殖壶菌油脂含量检测激发光直接设为490 nm，发射光为590 nm。根据目前报道的文献，微藻激发光一般在 480～520 nm[12～19]。本研究测定发射光范围时固定激发光为480 nm，发射光在520～660 nm范围内每隔0.2 nm进行一次荧光值检测。

测定激发光范围时，固定发射光为576 nm，激发光450～550 nm范围内每隔0.2 nm进行一次荧光值检测。由图1C、1D可见，最佳激发光为515 nm，最佳

发射光为576 nm。

2.2 背景荧光对尼罗红染色荧光强度的影响

依据以上实验结果，此部分实验条件拟定为DMSO浓度为20%，尼罗红浓度

1μg/mL，细胞密度OD600=1.2，常温避光染色10 min，分别测定了PBS缓冲液、菌液离心后上清、PBS细胞重悬液及发酵后菌液在激发光为515 nm，发射光在550～700 nm的荧光强度。

如图2所示，尼罗红对上清液和PBS染色，在发射光为560～700 nm范围内均

未产生明显峰值。与图1A无细胞培养基检测结果相同，DMSO浓度较低时，不

形成特征峰；用尼罗红分别与PBS细胞重悬液及发酵后菌液染色，尼罗红与油脂

结合在580 nm处产生峰值，且峰值相近，上清颜色并未对尼罗红与油脂结合产生影响。且尼罗红对上清及PBS染色在580 nm处荧光强度相近，对染色结果无明显影响。胞内油脂荧光强度等于菌液荧光强度值减去空白培养基尼罗红染色荧光强度值。

2.3 尼罗红浓度对荧光强度的影响

为考察尼罗红浓度对裂殖壶菌染色的影响，此部分实验条件设置为：DMSO浓度20%，细胞密度OD600=1.2，常温避光染色10 min，激发光为515 nm，发射光在550～750 nm范围内每隔10 nm进行一次荧光值检测。尼罗红浓度分别为0.5、1、2、5、8、10 μg/mL，结果见图3。

图1 DMSO浓度、发射光及激发光波长对荧光强度的影响Fig.1 Effects of DMSO volme ratio and excitation,emission wavelength on relative fluorescence intensity注：A：无细胞培养基；B：菌液OD600为1.2；C：发射波长的确定；D：激发波长的确定Note:A:Culturemediumwithout

cell;B:OD600=1.2;C:Determination of theemission

wavelength.D:Determination of theexcitation wavelength

图2 尼罗红在不同溶液中的荧光光谱图Fig.2 Fluorescencespectraof Nilered in differentsolutions

由图3A、B可知，尼罗红浓度在0～5μg/mL间，荧光强度随尼罗红浓度增加而增加。但尼罗红浓度大于5μg/mL后，荧光强度随尼罗红浓度增加而降低，且峰值右移，推测过高的尼罗红浓度会与DMSO结合，产生蓝移。而尼罗红浓度为

5μg/mL时，虽荧光强度最高，但峰值同样有一定的右移，尼罗红与油脂结合已饱和。尼罗红浓度为0～2μg/mL时，与荧光强度呈线性关系，当尼罗红浓度为

2μg/mL时，趋势线的R2值降低，且筛菌过程中菌液浓度较低时，使用2μg/mL 的尼罗红可能会过量，影响峰值。本着节约高效的原则选择1μg/mL的尼罗红染

色。

2.4 尼罗红染色细胞的时间对荧光强度的影响

为考察染色时间对荧光强度的影响，设定实验条件为尼罗红浓度1μg/mL，DMSO浓度为20%，细胞密度OD600=1.2，激发光为515 nm，发射光为576 nm。分别测定不同染色时间的荧光强度，结果见图4。由图4可知，染色时间在5～15 min范围内，荧光强度随染色时间延长而增强；15 min时，荧光强度达到最高，胞内油脂与尼罗红充分结合；染色时间在15～40 min范围内，荧光强度随染色时间延长逐渐减小。与文献[15]中报道的染色15 min荧光强度相吻合，但20～25 min内荧光强度降低相对平缓，数据较稳定。为在大批量筛菌时，能稳定测定荧光强度，减小随时间延长而产生的荧光衰减，选择20 min为最佳染色时间。图3 尼罗红浓度对荧光强度的影响Fig.3 Effects of Nile red concentration on relative fluorescence intensity

图4 染色时间对荧光强度的影响Fig.4 Effects of staining time on relative fluorescence intensity

2.5 细胞密度对荧光强度的影响及油脂含量与其荧光强度的相关性分析

实验条件为尼罗红浓度1μg/mL，DMSO浓度为20%，激发光为515 nm，发射光为576 nm，常温避光染色20 min。收集不同培养时间的菌液，测定细胞密度，荧光强度和菌体的总脂含量，考察细胞密度对染色的影响，并找到油脂含量与荧光强度的对应关系。结果见图5。

由图5A可知，当菌液OD600等于1.3时，荧光强度达到最高，OD600大于1.3时，荧光强度随菌液浓度升高不再变化；可能菌液密度较大时，1μg/mL尼罗红不能与全部的油脂结合，荧光强度趋于稳定[13]。由图5C可知，菌液OD600小于1.3，荧光强度与细胞密度呈正相关关系，其R2为0.9952。因此，用尼罗红对裂殖壶菌进行染色筛选时，细胞菌悬液的密度应在OD600＜1.3的范围内。

由图5B可知，油脂含量随细胞密度增加而增加，OD600在0～0.7范围内油脂含量缓慢增加，OD600在0.7～1.3范围内油脂含量快速增长。对尼罗红染色法获得的荧光强度与气相色谱法测定的油脂含量进行回归分析，结果如图5D所示。结合图5B细胞密度与油脂含量的关系，当OD600＜0.7，油脂含量小于0.2 g/L时，

荧光强度与油脂含量相关性良好，回归方程为 y=19852x+579.53，R²=0.9831；当0.7＜OD600＜1.3时，油脂含量在0.2～0.8 g/L范围内，荧光强度与油脂含量相关性良好，回归方程为y=5522.8x+3285，R²=0.9916（图5D）。说明荧光强度与油脂含量在一定范围内呈正相关关系。

虽荧光强度与细胞密度和油脂含量对应的相关性不完全吻合，但油脂含量随细胞密度增加而增加，荧光强度随细胞密度增加而增加。一定细胞密度范围内，测定的荧光强度可代表其相应状态的油脂含量。当0.7＜OD600＜1.3时，细胞密度和荧光强度及油脂含量与荧光强度的斜率相近，灵敏度更高，通过突变体的荧光强度和原始菌株OD600对应的荧光强度相比，可以消除不同突变体的浓度差异，减少浓度调整的工作量。因此在此范围内可通过细胞密度与荧光强度的对应关系快速筛选油脂含量提高的突变菌株。

3 讨论与结论

裂殖弧菌是美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)认证为GRAS（generally recognized as safe）的安全菌株，部分亚种的总脂含量可达

生物量的60%左右[7]，是包括中国在内多个国家批准的DHA商业化发酵菌株。

为了持续提高DHA的产量，降低生产成本，促进微生物发酵DHA产业长足发展，研究者致力于通过多种途径提高裂殖弧菌DHA产量，目前针对菌株改造的方法主要包括诱变筛选[7,21]和基因工程[22]。但由于法规的限制，诱变选育高产DHA

菌株仍是首选方案。裂殖壶菌主要的油脂成分为中性脂，DHA主要以中性脂的形

式储存在细胞内，因此建立快速、高通量的检测油脂含量的方法，是筛选高油脂含

量、高产DHA裂殖弧菌突变株十分重要的环节。

图5 细胞密度对荧光强度及油脂含量的影响Fig.5 Effects of cell density on relative fluorescence intensity and lipid content注：A：细胞密度对荧光强度的影响；B：细胞密度对油脂含量的影响；C：细胞密度与荧光强度的相关性；D：油脂含量与荧光强度的相关性Note:A:Effects of cell density on relative fluorescence intensity;B:Effects of cell density on lipid content;C:Correlation of cell density and fluorescenceintensity;D:Correlation of lipid content and fluorescence intensity

尼罗红荧光染色法应用于微生物胞内油脂染色已被广泛报道。尼罗红与油脂结合后由激发光激发产生光，而发射光产生的荧光强度是油脂含量判断的标准。不同微生物的脂质成分有所差别，激发光与发射光的选择也不同[14～16]，因此我们首先

系统地筛选了尼罗红荧光染色法应用于裂殖壶菌时最佳的激发光和发射光。

由于培养基有细胞碎片且发酵过程会产生一些代谢产物分泌到培养基中[19]，可能会对荧光强度产生干扰，本实验探究了培养基背景对荧光强度的干扰，结果显示PBS缓冲液与上清液尼罗红染色后荧光强度略有区别，但差异不显著，且对比了

尼罗红分别与PBS细胞重悬液及发酵后菌液染色效果，差异不显著，因此可忽略

培养基对荧光强度的干扰。此方法仅需500μL菌液，与传统的尼罗红染色法相比，不仅节省样品，更重要的是简化了PBS缓冲液洗涤重悬的过程，在大批量筛菌时

极大地减轻了工作量。

基于以上分析和讨论，本研究提出了通过细胞密度与荧光强度的对应关系快速筛选高含油量裂殖弧菌突变株的方法。优化的最佳染色及检测条件为：细胞密度 0.7＜OD600＜1.3，尼罗红浓度 1 μg/mL，DMSO浓度20%，激发光515 nm，发射光576 nm，常温避光染色20 min。通过比较不同细胞密度下气相色谱法测定的

油脂含量与荧光强度之间的关系，得出可通过细胞密度与荧光强度的对应关系快速

筛选突变菌株的结论。该方法的建立为筛选高含油量、高DHA含量裂殖壶菌突变株提供了技术保障。

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