吖啶橙溴化乙锭双荧光染色试剂盒
吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色试剂盒
简介：
吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA,属于异染性荧光染料， AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发橙红色荧光。溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)嵌合到双链DNA 或RNA 的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可透过活细胞膜，EB 不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 AO/EB 工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)， 按照试剂(A):试剂(B):试剂
(C)=1:1:8的比例稀释成AO/EB 工作液。
2、 每份细胞样品中加入AO/EB 工作液2μl ，混合均匀。
3、 低速离心，弃上清。
4、 用AO/EB Dilution Buffer 重悬细胞，细胞计数，将细胞密度调整为0.5~5×106个/ml 。
5、 加入1μl AO/EB 工作液，充分混匀。
6、 取洁净载玻片，滴加上5μl 细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。
7、 在荧光显微镜B 域进行观察。
染色结果：
注意事项：
1、用能通过活细胞膜与DNA 结合后发蓝色荧光的Hoechist 33342和只能通过死细胞与DNA 结合后发红色荧光的碘化吡啶( propidium iodide ，PI)对细胞进行双染的方法也比较常用。
编号 名称
DA0039 100T Storage
试剂(A): AO solution 200μl 4℃ 避光 试剂(B): EB solution
200μl RT 试剂(C): AO/EB Dilution Buffer 50ml
4℃ 避光 使用说明书
1份
活细胞 绿色荧光 死细胞
橙色荧光
1、EB solution有一定毒性，请小心操作。
相关：
编号名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
CC0130 胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)
DA0001 DAPI染色液(5ug/ml)
DA0020 Hoechst33342/PI细胞凋亡染色试剂盒
DA0065 台盼蓝染色液(0.4%)
DC0035 Pollak三色染色液
NH0043 SSC缓冲液(20×,pH7.0)
TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)
吖啶橙荧光染色法
吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染 色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子 也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两 种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显 示橘红色荧光 【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长 将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。
实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色
实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色 【实验目的】 掌握荧光显微镜的原理和使用； 掌握生物材料荧光染色的原理和应用。 【实验原理】 吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。 在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 （1）0.1mol/l pH7.0 PBS液 A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml； B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。（2）1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 【方法与步骤】 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min。 （3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
AOEB染色的讨论
吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 AO / EB原理与流程 zhongyisheng: 1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 2 AO/EB染色及观察结果：取20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。ym1051: 1.能否提供具体实验步骤? 2.您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng: 1 用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP管吹打即可。 2 消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。 ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗? zhongyisheng:的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。 医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享： 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴 化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡 的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用 15mg吖啶橙溶于100ml 的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞 百分数。 2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。 （有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS 中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显
免疫荧光双染
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1? （TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二
抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。 8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 (紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm) 石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯 n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)， 在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)? 和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内， 37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
细胞染色方法
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制 贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释 荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合， 染色与观察： 制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.
注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。 上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。 按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。 可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。
双标记免疫荧光染色
双标记免疫荧光染色 一、实验目的： 1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。 2.检测目的基因所表达的蛋白定位。 3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。 二、实验材料： 1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI 2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。 三、实验步骤： 1.细胞培养： 取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组； 2.实验组加药处理： 加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。 3.上镜前处理： 将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜； 第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次； 取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。 以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。 4.镜检 四、结果预测： 1.共表达： 两个基因分别为阳性红色，绿色。共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。 2.正负表达：看荧光强弱。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
吖啶橙溴化乙锭双荧光染色试剂盒
吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色试剂盒 简介： 吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA,属于异染性荧光染料， AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发橙红色荧光。溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)嵌合到双链DNA 或RNA 的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可透过活细胞膜，EB 不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 AO/EB 工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)， 按照试剂(A):试剂(B):试剂 (C)=1:1:8的比例稀释成AO/EB 工作液。 2、 每份细胞样品中加入AO/EB 工作液2μl ，混合均匀。 3、 低速离心，弃上清。 4、 用AO/EB Dilution Buffer 重悬细胞，细胞计数，将细胞密度调整为0.5~5×106个/ml 。 5、 加入1μl AO/EB 工作液，充分混匀。 6、 取洁净载玻片，滴加上5μl 细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。 7、 在荧光显微镜B 域进行观察。 染色结果： 注意事项： 1、用能通过活细胞膜与DNA 结合后发蓝色荧光的Hoechist 33342和只能通过死细胞与DNA 结合后发红色荧光的碘化吡啶( propidium iodide ，PI)对细胞进行双染的方法也比较常用。 编号 名称 DA0039 100T Storage 试剂(A): AO solution 200μl 4℃ 避光 试剂(B): EB solution 200μl RT 试剂(C): AO/EB Dilution Buffer 50ml 4℃ 避光 使用说明书 1份 活细胞 绿色荧光 死细胞 橙色荧光
免疫荧光染色
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
吖啶橙染色液
吖啶橙染色液 吖啶橙染色液(1mg/ml) 产品简介： 吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。 (1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。染色 后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 自备材料： 1、 荧光显微镜 2、 低速离心机 3、 PBS 4、 细胞计数板 5、 载玻片、盖玻片 操作步骤(仅供参考)： 1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节
细胞浓度至106/ml。 2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17 μg/ml，轻轻混匀。 3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。 4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。 染色结果： 正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光 凋亡细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被 染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒 注意事项： 1、Acridine Orange Stain(1mg/ml)不含破膜剂，较少单独使用。 2、吖啶橙染色常与EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 3、如有低温离心机进行离心效果更佳。 4、操作过程中应注意减少试剂暴露于强光下的时间。 5、试剂有一定毒性，请小心操作。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：6个月有效。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
细胞自噬预实验
细胞自噬预实验 化学染色法 1、试验目的 通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。 2、试验原理 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。 3、试验材料及试剂 HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、 0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片 AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。 4、试验方法 1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物
处理48h。 2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。 4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀 6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片 7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。
吖啶橙荧光染色法
. ’. 吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙（acridine orange ，AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA 和RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm ，荧光发射峰为530nm （DNA ）、640（RNA ），它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm ），核仁和胞质RNA 发橘红色荧光（>580nm ）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA 、RNA 两种核酸。 【实验用品】 1、 器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、 试剂 （1）0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH 2PO 4·H 2O 2.76g ，加蒸馏水至100ml ； B 液：Na 2HPO 4·7H 2O 5.36g ，加蒸馏水至100ml ； 取A 液16.5ml ＋B 液33.5ml ＋NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至100ml 。 （2）1%吖啶橙原液 取0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml （临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS 溶液稀释10倍）。 3、 材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min 。 （3）滴加0.01%吖啶橙染液5min 。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色 【注意事项】 （1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 （2）每种荧光染料，均有自己的最适pH ，此时荧光最强。当pH 改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH 缓冲液中进行。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 来源：生物谷 2008-6-27 访问量：9826 评论（0）分享 一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）。 5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。 6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。 7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。 2、每次试验时，需设置以下三种对照： （1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物 （2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物 （3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。 5、其余同一般操作。 原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白—{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet—1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共 聚焦显微镜观察) 1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。 2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化—抗兔IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化—抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC—抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。 双重免疫荧光标记法 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
吖啶橙
技名词定义 中文名称： 吖啶橙 英文名称： acridine orange 定义： 可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。所属学科： 细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。 简称：AO AO能与无机酸形成盐，具有绿色荧光。如果再稀释的话，便水解成游离的AO，而呈现紫色荧光。 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）： （1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L 溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。 （2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。