细胞培养各种培养基简介
精心整理DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞培养综述
细胞培养综述 摘要：为了模拟机体生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。培养出的活细胞具有量大、均一和可重复性的特点，可以通过各种物理、化学、生物等因素进行调控，并且可以通过倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等多样的方法进行研究，已广泛运用在不同科学研究领域。 关键词：分化，细胞分型，生长增殖过程，传代 一、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系[1]。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启
引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为[2]。 二、体外培养细胞的分型 （一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态[3]。 3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其
细胞培养基本方法.docx
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
细胞培养技术个人总结
总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
细胞培养基种类及用途
基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。 据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,?还可补加新成分。?如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。 合成培养基使用时加5-30%血清。 1． 199细胞培养基及其改良品种 1950年Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，广用于各类细胞培养，广泛用于病毒学、疫苗生产。 2． BME细胞培养基 基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMEM等。 3． MEM细胞培养基 低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 4． DMEM细胞培养基及其改良品种 DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖(1000mg/L)、高糖(4500mg/L)。生长快，附着稍差肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 5． IMEM细胞培养基 IMEM由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。 6． RPMI-1640细胞培养基 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养 7．Fischer’s细胞培养基 用于白血病微粒细胞培养。 8． HamF10、F12细胞培养基 1963年、1969年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。 9． DMEM/F12细胞培养基 DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 10． McCoy5A培养基 1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
细胞培养技术
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
细胞培养知识
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培
养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
细胞培养合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方，是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种，有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。 一、基本组分 基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 ●无机盐：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 ●氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50％，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。 ●维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、 D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C 也是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。 ●碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含 的能源物质。 ●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明，体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸，这降低了营养物质的代谢效率，降低培养基pH值，增加渗透压。在氧气供给不足的情况下，NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+，细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+，从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足，细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。 在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，其能量代谢通路与体内完全不同，表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量，谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径，另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此，适当的调整细胞内的代谢途径，使之能促进细胞的快速生长和产物合成，同时减少代谢抑制物的生成是行之有效的一种策略。 许多动物细胞如CHO、BHK和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言，二者的快速利用并非细胞必需；相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是两种主要代谢废物，其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累，是大规模细胞培养技术研究的重要方向。 氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。 ●除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入酚红（当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于 8.4呈红色），一种pH指示剂。 ●在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。 二、常用细胞培养基 (1).MEM细胞培养基系列 (2).DMEM细胞培养基系列 (3)RPMI-1640细胞培养基系列
血管内皮细胞培养
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
H9c2细胞培养方法
大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
从二维到三维细胞培养的变迁
从二维到三维细胞培养的 变迁 Newly compiled on November 23, 2020
细胞培养技术进展概述及分析 细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分。无论是进行细胞性状研究，还是进行细胞产物的研发，都需要以细胞体外扩增技术-即细胞培养技术为基础。随着生命科学的发展，细胞培养技术更是被广泛应用于生物学、、新药研发等多个领域，成为生命科学最重要的基础技术之一。 传统的细胞培养即细胞的平面培养，细胞在培养过程中只能沿平面延伸，属于细胞的二维培养技术。这种培养方式经济、便利、易操作，符合某个历史阶段对细胞培养技术的要求。但随着研究的深入，传统的二维培养技术已经不能满足细胞培养需求。盖因生物体内的细胞是在立体三维的微环境中生长的，二维培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。传统的二维培养技术，已经成为细胞学为基础的众多学科进步的壁垒之一。 科学家开始寻求更贴近自然状态的细胞培养技术。一种与活体组织内的细胞外基质相似的，能更好的模拟细胞在体内生长环境的培养技术，即细胞的三维培养技术。 目前已开发出很多细胞三维培养技术，大致可分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。支架类主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构, 细胞依附于支架进行三维生长和迁移, 主要的支架材料有胶原和水凝胶等；而不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的, 目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
细胞培养基本技术及免疫细胞的培养方法
细胞培养 第一节细胞培养基本技术 一、免疫细胞分离技术 1、淋巴细胞的分离 取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴 流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混 合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而 下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。 用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面 上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次 2000r／min离心10min，最后用RPMI l640培养液将细胞配成 2×106／m1的细胞悬液备用。 2、T细胞及B细胞的分离 将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T 细胞则不粘附，先用RPMI l640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细 胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘 附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMI l640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。 3、CD4细胞及CD8细胞的分离 （1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。 （2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。 4、单核巨噬细胞的分离 单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02温箱内温育1小时，然后用RPMI 1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。 二、肿瘤细胞株的传代培养 传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60－70条左右。③保留种属特异性，但组织分化性与脏器特性均消失。④具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获取、易保存，已为各实验室广泛采用。 1、HeLa细胞的传代培养 试剂与仪器 ●HeLa细胞。