枯草芽孢杆菌的应用

学年论文（课程设计）

题目：枯草芽孢杆菌的应用

学院生命科学学院

学科门类理科

专业生物技术

学号2010445059

姓名陈家怡

指导教师郭立格

2012年7月6日

目录

枯草芽孢杆菌的应用 (3)

摘要 (3)

ABSTRACT (4)

1.枯草芽孢杆菌的基本资料 (5)

1.1简介 (5)

2.枯草芽孢杆菌的研究现状及主要应用领域..................................................................................-5-.

2.1枯草芽孢杆菌的研究现状 (5)

2.2枯草芽孢杆菌的主要应用领域 (5)

2.2.1枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (5)

2.2.1.1纳豆激酶的发现及应用 (5)

2.2.1.2 脂肪酶 (6)

2.2.2枯草芽孢杆菌在农业中的应用 (6)

2.2.2.1枯草芽孢杆菌在饲料中的应用 (6)

2.2.3 枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用 (6)

2.2.4 枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用 (6)

2.2.5枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用 (7)

2.2.5.1枯草芽孢杆菌表达系统的研究 (7)

2.2.5.2枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究 (7)

3.枯草芽孢杆菌应用中存在的问题 (7)

4.枯草芽孢杆菌制剂作用机理及应用效果 (7)

4.1枯草芽孢杆菌的作用机理 (7)

4.1.1生物夺氧 (7)

4.1.1.1拮抗致病微生物，改善体内外生态环境 (8)

4.1.1.2增强动物体的免疫功能 (8)

4.1.1.3产生多种消化酶 (8)

4.1.1.4产生多种营养物质 (8)

4.2枯草芽孢杆菌在动物生产上的应用效果 (9)

5.展望 (9)

参考文献 (9)

枯草芽孢杆菌的应用

摘要

在如今的世界环境恶劣的大情况下防治多种现代生物疾病，除了如何能够做到较好的解决这类病虫害问题之外，还应达到绿色植保的要求，尽可能不用化学试剂。经研究发现枯草芽孢杆菌在许多方面上具有比化学试剂更优良的防治效果，例如在营养保健方面、在农业、养殖业方面、在现代科学研究中等等，同时它也具有比化学试剂更好的发展前景。

本文主要介绍其在主要应用领域的效果以及相关效果优化方面的最近研究成果，包括纳豆激酶、脂肪酶的应用、枯草杆菌基因工程等等，以及枯草芽孢杆菌的未来发展前景。

关键词：枯草芽孢杆菌应用生物防治发展前景

ABSTRACT

As the fact that the enviroment of the world becomes worse and worse. During the large kinds of biological disease prevention and control, so not only how to slove this problem better, but also we should meet the requirement of green plant protection, which means we must use chemical reagent as less as we can. The study find that Bacillus subtilis has more good effect than chemical reagent, for example at nutrition and health

care, at agriculture and breeding, during modern scientific research and so on .At the same time, it also has more excellent prospects than the chemical reagent.

This article mainly introduces in the main application fields, the Bacillus subtilis’s effec t and how to improve its effect, including the application of the accept beans kinase and the lipase, the Bacillus subtilis genetic engineering and so on. Also talks about the Bacillus subtilis’s future development prospect.

Key words: Bacillus subtilis application biological control development prospects

前言

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对

此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。属革兰氏阳性菌，由于其分泌能力强，无内毒素，已成为一种重要的GRAS（generally recognized as safe）有机体[1]，被科研人员广泛用于基因工程中的转基因宿主。

一枯草芽孢杆菌的主要应用

国内一些单位对具有生防作用的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等。不同菌株的抑菌谱、抑菌作用乃至抑菌机理等亦有较大差异。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株对不同作物的真菌和细菌病害具有拮抗作用的枯草芽他杆菌菌株，并采用人工诱变方法提高了菌株的防病效率，对这些菌株进行了发酵条件的研究，分离出一些抗菌物质并对其特性进行了研究，同时开展了生防菌剂的温室和大田试验。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”(10亿／g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册；江苏苏科农化有限公司的纹曲宁是100亿活芽孢／ml枯草芽孢杆菌水剂和2.5％井冈霉素的复混制剂，等等许多方面都有了新的进展。

1.1枯草芽孢杆菌在营养保健方面的应用

枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中能够应用到营养保健领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶和脂肪酶两种。丝氨酸纤溶性蛋白酶，即纳豆激酶。此外，我国的豆豉纤溶酶和韩国的大豆发酵食品中分离的纤溶酶也都是枯草芽孢杆菌分泌的丝氨酸纤溶性蛋白酶的一种，只是发酵用的菌株有些细微差别。

1.1.1纳豆激酶的应用

1987 年，日本学者经过对上百种食物的筛选，首次发现日本传统的大豆发酵食品纳豆中含有溶解血纤维蛋白的成分，并将其命名为纳豆激酶（Nattokinase，NK）。通过狗的模型试验及健康人群的体内研究，证明其除了具有显著的溶栓作用外，还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力，从而间接地表现其溶栓活性。与传统的溶栓剂相比，NK具有不易引起出血、无抗原性半衰期长安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而具有广阔的开发前景，可能成为新一代的溶栓药物[2-3]。

1992 年，Nakamura 等首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列，使得利用基因工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能[4]。近年来，我国掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮，纳豆激酶的药用价值日益突出，通过利用基因工程菌生产纳豆激酶，致使对纳豆激酶基因的克隆表达、纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了很大进展在我国传统大豆发酵食品豆豉中发现了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶，将其产生菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并将豆豉纤溶酶基因克隆到了毕赤酵母中[5]。与此同时，韩国也在其传统大豆发酵食品中发现了类似的纤溶酶。近期，陈晔等通过枯草芽孢杆菌培养，利用（NH4）SO4沉淀、Sephadex G100 柱层析对该酶发酵液进行分离纯化，已经分离纯化出了枯草芽孢杆菌2

（B.subtilis ZY21）[6]溶栓酶。

以上研究证明，日本、中国及韩国先后发现的这3种纤溶酶应该均由枯草杆菌分泌的，只是菌株不同而已。

1.1.2 脂肪酶

脂肪代谢最基本的酶是脂肪酶，其缺乏将会引起健康问题，通过脂肪酶的外部调节可达到助消化的目的。微生物脂肪酶被用来从动物和植物中获得多不饱和脂肪酸，而多不饱和脂肪酸作为生物药物和营养成分起着越来越重要的作用；游离的多不饱和脂肪酸及其单双甘酯又是用来生产各种药物（抗胆固醇、抗炎药）的原料。脂肪酶是一类能在油水界面上水解甘油三酯酯键的酶的总称，广泛应用于食品、生物医药、化工、化妆品以及生物柴油等传统与现代工业[7-8]。枯草芽孢杆菌168的脂肪酶以其广泛的底物作用范围，较小的分子质量以及较高的等电点等优良酶学特性而日益受到人们的关注[9]。马吉胜从原始的枯草杆菌质粒pBD64 出发，通过设计两段DNA 片段，引入了多个酶切位点和一个强启动子序列，构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒pBSR2，并进一步研究了这种酶的分子质量、酶活力、最适反

应温度、最适反应pH、反应动力学等基本酶学性质[10]。

1.2枯草芽孢杆菌在养殖业和农业中的应用

由于枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，所以枯草芽孢杆菌常用于养殖业中。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，能够杀灭一些动植物中常见的病源菌。

1.2.1枯草芽孢杆菌在动物饲料中的应用

纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus sublitisnatto）是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是我国农业部公布的12 种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂之一[11]。犊牛消化酶系统发育不健全，出生后蛋白酶系尚未建立完全，胃蛋白酶产生较晚，对固体物质和非乳物质的消化能力弱；免疫系统功能不完善，胃及肠对细菌的抵抗力很弱，抗疾病的能力较差，外界环境不良时，易被大肠杆菌、沙门氏杆菌等病原菌侵袭，从而引起犊牛胃肠疾病，严重时甚至造成死亡。作为可直接饲用微生物，纳豆芽孢杆菌能在肠道内生长，分泌各种酶和维生素，促进小肠黏膜细胞的增殖，促进胃肠道各种消化酶活性，并具有抑制肠道内有害菌的作用。犊牛直接饲喂纳豆枯草芽孢杆菌对增强犊牛机体免疫和促进胃肠发育具有良好的效果。日粮中添加枯草芽孢杆菌能提高瘤胃发酵产气量，提高瘤胃氨态氮、总挥发性脂肪酸及丙酸含量，降低瘤胃乙酸：丙酸，提高瘤胃纤维的降解，能有效提高日粮的利用率，可以推广应用[12]。

1.2.2 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的作用

枯草芽孢杆菌在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解、吸收水及底泥中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机物，有降低水体富营养化和清除底泥的作用。在作用过程中，有机营养一部分转化为细胞物质，大部分转化为细菌活动的能量。在其转化过程中，氨气、氮气就从水中逸散到大气。用这种方法，水中氨氮和硝基氮可除去80%～90%。另一部分有机营养转化为优势的有益菌体。此法广泛应用于河蟹育苗、虾类养殖以及河屯、黄鳝、鱼、甲鱼养殖[13]。

1.2.3 枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用

随着人们环保意识的加强，生物防治因其对环境生态和人类健康安全的优点，受到各国政府的广泛重视，并发挥着越来越重要的作用。应用枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史，目前全世界收集保存了几百株野生型枯草芽孢杆菌菌株，研究证实该种革兰氏阳性细菌能够产生40 多种具有不同结构的抗菌物质，其中很多具有优良性状的菌株已经应用于生产实践，例如，上世纪90年代，唐文华等和刘伊强等将枯草芽孢杆菌与Bt通过细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子，从而使得该菌既有抗虫性又有抗药性，成为一种极有前景的农药制剂[14]。美国的GBO3、MBI600、QST713 和B．subtilisvar．amyloli quefaciens FZB24，澳大利亚开发的B．subtilis A213，日本东京技术研究所的B．subtilis RB-14，中国开发的B916、B908、B3、B903、XM16等[15]。王益民将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进行细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子CF103，田间试验结果显示，CF103 能兼治水稻纹枯病和稻纵卷叶螟，对照区病情指数为49.8% 、虫害率为41.5%，而防治区分别为0% ～36.9% 和1.7%～12.1%。陈中义等构建了含有CrylAc 基因的两个穿梭表达质粒载体[16]，导入生防枯草芽孢杆菌B916，获得了兼有杀虫防病效果的基因工程菌Bs2014和Bs2249，同时还将CrylAb 、CrylAc 、Cry12Aa 等杀虫基因导入B916 并获得了一系列单价和双价杀虫防病工程菌[16]。同时以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭RB-质粒pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将Bt HD21杀虫蛋白基因Cry1Ac 导入了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916[17]。

1.3枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用

自1958年Spizizen发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因以后，随着DNA 重组技术的建立特别

是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）带抗性标志的质粒可作为其载体的发现，枯草杆菌基因工程研究迅速发展。芽孢杆菌作为原核表达系统与大肠杆菌表达系统有很大的区别，芽孢杆菌不能识别大肠杆菌的启动子，因此构建表达外源基因的枯草杆菌表达系统是研究者关注的问题。目前尚无商品化的枯草芽孢杆菌专用表达载体，为构建枯草芽孢杆菌的表达载体，获得枯草芽孢杆菌能够识别的启动子序列是首要条件。陈晓月等根据GenBank中枯草芽孢杆菌的P43启动子基因序列，设计合成了一对引物，用PCR方法钓取枯草芽孢杆菌AS．1655 菌株的P43启动子基因，PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，连接到pMD18T-simple 载体上，进行序列测定。测序结果表明，枯草芽孢杆菌AS．1655 菌株的启动子全长427 bp ，由两个叠加的启动元件组成，分别为σ55 和σ37 RNA 聚合酶识别的位点，与GenBank 中的和σ37 RNA 聚合酶识别的位点，与GenBank中的枯草杆菌P43 启动子的基因序列高度保守[18]。

二枯草芽孢杆菌应用中存在的问题

枯草芽孢杆菌的产业化应用尚不成熟。首先是在医药方面，我们尽管已经证明了枯草纤溶酶具有良好的溶血栓效果，但是在国内相应的商品化的药品却不多见。而且枯草脂肪酶用于制作相应的药物还不成熟，有待进一步研究。其次，在农业方面一些相应的生物农药和饲料也没有得到大范围的应用。这主要是由于科技的不均衡性和理论转化为实际的考察期较长造成的。枯草芽孢杆菌自身有需要克服的问题。枯草芽孢杆菌虽然可以直接作用于农业来抗一些植物病虫害，然而，天然野生型微生物菌剂存在天生的不足，如产品持效期短、见效慢、作用对象比较单一、易受自然环境影响、竞争存活能力有限等[19]。尽管枯草芽孢杆菌已经作为表达系统并在试验中应用，但是其自身具有的多酶体系使得转入它的外源质粒不太稳定，从而使其作为表达系统有一定的困难。

三展望

尽管枯草芽孢杆菌在应用中存在一些问题，但是人们也在不断地研究克服其缺点的方法，例如陈乃用早在1993 年就详细地分析了枯草芽孢杆菌的质粒稳定性问题，并提出了一些相应的解决措施，可以说枯草芽孢杆菌成为像大肠杆菌那样成熟的表达系统只是时间问题。同时枯草芽孢杆菌中的其他酶，如淀粉酶和蛋白酶也逐渐成为了人们关注的热点。这些都将会为枯草芽孢杆菌的应用开拓新的领域。随着科学技术的不断进步，那些限制枯草芽孢杆菌应用的问题将逐一被解决，而枯草芽孢杆菌也必将迎来一个更宽广的应用空间！

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