微生物学实验指导.
微生物实验守则
微生物学实验的目的是：加深对微生物学理论知识的理解；扎实掌握实验的基本操作，并牢固建立无菌操作的概念；培养学生认真观察、发现问题、分析问题和解决问题的工作能力；树立学生实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、协作攻关的优良作风。
为了提高教学效果，保证实验质量和实验室安全，特提出如下注意事项。
1.每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法，熟悉实验操作中的主要步骤和环节。
2.非必要的物品不要带入实验室，必须带进的物品应放在不影响实验操作的地方。
3.实验时认真听教师的讲解，仔细观察示范操作。
4.许多微生物有潜在的致病能力。实验中要严格无菌操作，以免培养的微生物进入外界环境，并保证所培养的微生物不受污染。
①实验室内严禁餐饮。
②实验前洗手并用酒精棉球擦拭手和台面。
③实验操作过程中，要严格进行无菌操作，以防止菌体间交叉感染或致病菌对人体造成危害。
④在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流，要尽量减少走动和讲话，以防止尘埃飞扬和唾沫四溅。
⑤用过的带菌吸管、滴管、玻片、涂布棒和移液器枪头等，用酒精或来苏尔等浸泡以后再进行清洗。
⑥离开实验室之前要用肥皂洗手。
⑦实验室中的菌种和物品等，未经教师允许，不得携带出实验室。
凡需进行培养的材料，都应注明菌种名、接种日期、处理方法及操作者姓名（或组别），放在制定的培养箱中进行培养。
5.如发生培养菌的器皿打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况时，应立即报告指导教师，及时处理，菌液污染实验台面或其他物件时，应及时用3％的来苏尔或5％的石炭酸液擦拭消毒。
6.爱护仪器、设备，严格按照操作规程使用仪器、设备，以确保仪器的安全和学生的人身安全，并做好使用记录，确保仪器的正常使用。
7.按时观察实验现象，认真及时的做好实验记录，对于当时不能得到实验结果而需要连续观察的，则需记下每次的实验结果，以便分析。清晰填写实验报告作业，科学阐述实验结论。
8.节约水、电，适量取用药品等耗材。
9.实验结束后，应将实验记录交指导教师审阅及检查，经同意后方可结束实验。实验完毕，认真清洗个人器皿、保养仪器、清理试剂和清洁台面，确保实验以后各种药品和仪器回归原位，台面干净整洁。
10.值日生负责打扫实验室卫生及检查实验室安全状况（门窗、水、电、煤气等）。
实验一微生物学实验基础
一、目的要求
1.熟悉实验室的各种仪器与设备。
2.学会制作棉塞的与包扎玻璃器皿，了解玻璃器皿的洗涤方法。
二、实验材料
实验室内各种仪器、培养皿、三角瓶、试管、纱布、棉花、棉线、牛皮纸、剪刀等。
三、实验内容
（一）微生物实验室常用仪器和设备
1.显微镜
显微镜是微生物实验中常用的仪器，应对它非常的熟悉。
根据光源不同，显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（或者紫外光）为光源，后者以电子束为光源。在我们的实验中常用的是光学显微镜。光学显微镜有多种，主要有普通光学显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜等。
在我们的实验中最常用的是普通光学显微镜，下面介绍它的主要构造。
（1）普通光学显微镜构造
此类显微镜的构造主要可分为两部分：机械部分和光学部分。显微镜的机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配合和灵活调控。光学部分由物镜、目镜、聚光器、光源、反光镜等组成，它们直接影响显微镜的性能，是显微镜的核心部分。
图1-1显微镜的构造图
（2）普通光学显微镜的使用方法：
①取镜安放：
取镜：右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）。
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安放：放置桌边时动作要轻。一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边7～10 ㎝处，以便观察和防止掉落。
②低倍镜的使用：
观察任何标本都必须先用低倍镜。
放置切片：升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。
调焦：将要观察的玻片标本放在载物台通光孔的中央，玻片标本两端用压片夹夹紧，再用手沿顺时针方向旋转粗调节器，把镜筒徐徐降到接物镜头差不多接近玻片标本（约半厘米）为止（从侧面观察下降镜筒）。然后左眼观察，边观察边用调节器将镜筒徐徐上升（逆时针方向旋转粗调节器）直到发现物象，观察清晰为止。如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节（不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头）。
③低倍镜的观察由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。
④高倍镜的使用
选好目标：如果要观察视野内某部分更细微的结构，则需要用高倍镜观察。先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。再用粗调节器徐徐将镜筒距离调整，至视野中出现物象，然后用细调节器调节到看清物象止（用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）。
调焦：在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。
在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜。
⑤油镜的使用
高倍镜下观察的标本，如果放大倍数还不够，可用油镜，换用前，同样要先在高倍镜下观察，把要观察的部分放在视野的正中央。观察到清晰的物象之后，在盖玻片上表面的中央滴一小滴香柏油，再换上油镜头，使油镜头与香柏油接触，然后由目镜观察。一边观察，一边用手稍移动细调节器（切忌用粗调节器）以看清物象。用油镜观察完毕后，转开油镜，必须用擦镜纸点二甲苯擦去镜头上的香柏油。下降镜筒，直立反光镜，使光学部件的光线不再对在一条直线上。
应当了解的是，在显微镜中观察到的物象是倒象，因此移动玻片时，应注意移动方向。如果要使物象左移动就要向右移动玻片，同样要使物象向前移动，就要向后移动玻片。
⑥使用后的整理
观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。清洁完毕，再下降镜筒，使物镜和载物台处于最大距离处，然后移动转换器，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂，左手平托镜座，按号放回镜箱中。
（3）显微镜的保养
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①取送显微镜时，必须右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。
②显微镜的使用，一定要按实验指导写的方法和步骤，认真仔细去做，不然，容易损坏标本和镜头，又达不到看清物象的目的。
③观察标本时，一定要先用低倍镜观察，再用高倍镜，低倍镜能看清，就不必用高倍镜。
④不能用硬纸擦透镜，必须用干净的擦镜纸，朝一个方向擦拭透镜，以免损坏镜头。
⑤不要随便转动粗细调节器，以免机器损伤，调节失灵。
⑥载物台要保持清洁、干净，不要让水或其他液体（酸、碱或其他化学药品等）流到台上，以免生锈或腐蚀。
⑦避免阳光直接照射，要防潮湿、防灰尘，经常保持镜体和镜体箱的干燥和清洁。
2、高压蒸汽灭菌锅
应用最广、效果最好的灭菌器是高压灭菌锅。用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、玻璃器皿等的灭菌。其种类有手提式、直立式、横卧式等（图1-2），他们的构造及灭菌原理基本相同。
图1-2-1 手提式高压蒸汽灭菌锅
立式高压蒸汽灭菌锅普通卧式高压蒸汽灭菌锅圆形卧式高压蒸汽灭菌锅
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高压蒸汽灭菌锅主要构造为一双层金属圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，上方或前方有金属厚盖，盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而锅内压力可升高，其温度也相应增高。高压蒸汽灭菌锅还装有排气阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度，并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力表，指示内部的温度和压力。
3、超净工作台
是进行微生物无菌操作的工作台，它能在局部形成高净洁度的环境。其工作原理是借助鼓风机将外界空气强行通过一组过滤器，净化的无菌空气连续不断地进入操作台面，并且台内设有紫外线杀菌灯，可对环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。
4、培养箱
培养箱又称保温箱，是培养微生物的主要仪器。
培养箱一般为方形或长方体形，外壳是喷漆的铁皮或优良塑料材料，内壁为铝板，夹层填充石棉或玻璃棉等绝缘材料以防止温度扩散。内层底部安装电阻丝用以加热，利用空气对流，使箱内温度均匀。
5、干燥箱
干燥箱又称烘箱，是一种常用于物品干燥的仪器，加热范围一般为30-300℃。不同类型的干燥箱由于用途、要求不同，构造略有差异。其构造与传统的培养箱基本相同，只是底层下的电热量大。主要用于玻璃仪器的灭菌，也可用于洗净的玻璃仪器的烤干。
6、离心机
离心机的主要用途是使液体标本达到离心沉淀的目的。其原理是利用离心力的作用，将浊液固液分离。（二）棉塞的制作与玻璃器皿的包扎
1、棉塞的制作
常用的棉塞有试管塞和三角瓶塞，其制作方法基本一致，具体步骤见图1-3。
图1-3 棉塞的制作
合格的棉塞不合格的棉塞
图1-2 合格与不合格棉塞的对比图
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2、玻璃器皿的清洗
玻璃器皿的清洁与否，常会影响实验结果的准确性，所以在使用之前，对玻璃器皿要进行洗涤。
（1）新玻璃器皿新玻璃器皿含有游离碱，初次使用时，应先在2％的盐酸水溶液内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。
（2）带油污的玻璃器皿可先在50g/L的碳酸氢钠液内煮两次，再用肥皂和热水洗涮。
（3）带菌的玻璃器皿
滴管和吸管：投入3％的来苏水或5％的石炭酸溶液内浸泡数小时或过夜，或经高压蒸汽灭菌后，用自来水及蒸馏水冲净。
载玻片及盖玻片：先浸入3％的来苏水或5％的石炭酸溶液内，然后用夹子取出经清水洗净，再放入95％的乙醇中，使用时在火焰上烧去乙醇，或用软布擦干使用均可。
其他的带菌玻璃器皿：应先经121℃高压蒸汽灭菌，20-30min后取出，趁热到处容器内的培养物，再用热水和肥皂水刷洗干净，用自来水冲洗。
3、玻璃器皿的包扎
试验中的各种玻璃器皿常常要进行灭菌处理，为了使灭菌后仍能保持无菌状态、以及防止在灭菌过程中带有样品的玻璃器皿内的蒸汽冲破棉塞，导致器皿内的样品喷溅出来，所以，在灭菌之前对需灭菌的器皿进行包扎。
①培养皿
洗净、干燥后，一般每6套（可视情况改变数量）叠放在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用棉绳捆扎紧，然后进行灭菌后备用。灭菌后的培养皿，一定要使用时才能打开牛皮纸，以免微生物再次污染。
②试管
洗净、干燥的试管，塞上合格的面塞，面塞入管2/3，管外留1/3，同规格的7支（可视情况改变数量）用棉绳捆扎在一起，试管上半部分外包纱布和牛皮纸，再用棉绳捆扎紧后准备灭菌，灭菌后，用时再打开。如果试管内有培养基等，应注明。
③三角瓶
三角瓶每个需要单独塞好棉塞，用牛皮纸包扎，用棉绳扎紧后待灭菌。灭菌后，用时再打开。如果瓶内有待灭菌的物质如培养基、生理盐水等，应注明。
四、实验报告
1.普通光学显微镜的构造主要分为哪几部分？
2.带菌玻璃器皿怎么洗涤？
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实验二染料及培养基的配制技术
一、目的要求
1.掌握常用染料的配制技术。
2.掌握配制培养基的一般方法和步骤，熟悉高压蒸汽灭菌锅的使用。
二、基本原理
染料分为天然染料和人工染料。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，他们多从动植物体内提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。为使他们易溶于水，通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离子所带的电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四类。
酸性染料：这类染料电离后染料离子带负电，可与碱性物质结合成盐，如伊红、刚果红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等。当培养基因糖类分解产酸而是pH下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。
碱性染料：这类染料电离后带正点，可与酸性物质结合成盐，如美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿、番红等。在一般情况下，细菌易被碱性染料染色。
中性（复合）染料：酸性染料和碱性染料的结合物叫中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等。后者常用于细胞核的染色。
单纯染料：这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为他们大多都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂类溶剂中，如紫丹类的染料。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，再调整pH。
此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，所以，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分或改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。
三、实验材料
1.试剂：美兰、95%乙醇、氢氧化钾、蒸馏水、碱性复红、石炭酸、结晶紫、草酸铵、碘片、碘化钾、番红、孔雀绿、石炭酸、乳酸(比重1．21) 、甘油、棉蓝（即苯胺蓝）；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖、可溶性淀粉、硝酸钾、马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水等。
2.仪器和器材：电子天平、玻璃棒、烧杯、药匙、称量纸、卫生纸、白色滴瓶、棕色滴瓶、分装漏斗、电磁炉、白瓷杯、试管、三角瓶、高压灭菌锅等。
四、实验内容
（一）几种常用染料的配制
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参照附录一、配制吕氏碱性美兰染色液、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、芽孢染色液和乳酸石炭酸棉蓝染色液。配制完成后，贴上标签，注明染料的种类，配制时间，组别。
（二）培养基配制的一般步骤
1、计算称量：根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后取少于总量的蒸馏水于白瓷杯中，分别称取培养基成分（除琼脂外），并按顺序逐一加入水中（有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解；对于酵母膏和牛肉膏等原料，在称量后要连同称量纸一起投入水中，待原料被洗下后再将称量纸取出；对于马铃薯培养基，需要先将土豆切成均匀的小块，然后加水煮至沸腾，并维持15min，用纱布过滤，取溶液部分进行培养基的配制）。
2、溶解：将白瓷杯放在电磁炉上，用文火加热，不断搅拌，并缓慢加入琼脂，待各药品完全溶解后，定容至所需体积。
3、定容：用蒸馏水补足至所需体积。
4、调节pH：用精密pH试纸或酸度计进行测定，并用10％的NaOH或10％HCl溶液进行调节，调pH时要尽可能的避免回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。
5、过滤：液体培养基用滤纸过滤，固体培养基则可以用4层纱布趁热过滤。但是供一般使用的培养基，这步可以省略。
6、分装：①分装三角瓶：将融化的培养基倒入三角瓶中，其装量以
不超过三角瓶总容量的3/5为宜。
②分装试管：将融化的培养基加至漏斗上，分装时左手并排拿着数根
试管，右手控制弹簧荚开关（如图2-1），将培养基依次加入各试管。用于
制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的1/5，分装时谨防培养基沾在
管口上，从而造成污染。
7、加塞，包扎，贴标签（标签上要注明培养基的名称、组别或个人
名字、日期等）。
8、灭菌（常用高压蒸汽灭菌）。图2-1分装示意图
9、无菌检查：检查的一般方法是放在37℃培养箱中培养过夜，如果没有染菌，则证明灭菌彻底，反之，则需要重新灭菌。
按照上述步骤，参照附录二的配方，配制牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基。
（三）灭菌（高压蒸汽灭菌）：高压蒸汽灭菌锅一旦发生事故，后果非常严重，所以要严格按照操作说明进行每一步的操作，并要注意以下的注意事项：
1、灭菌之前首先要检查灭菌锅的水是否加好；
2、灭菌锅内装的东西不可过满，否则会导致灭菌不彻底；
3、灭菌锅盖一定要拧紧，防止热蒸汽冲开锅盖而发生事故。
4、灭菌过程中，要有专人看守，一旦发现故障，应立即关闭电源，并报告指导教师；
5、灭菌完毕后，应等到压力降至零以后，方可打开锅盖。
五、实验报告
1．为什么一般情况下，细菌易被碱性染料染色？
2．简述配制培养基的一般步骤。
3．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
4．简述高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。
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实验三细菌的简单染色及形态观察
一、实验目的
1.学习微生物涂片、染色的基本技术。
2.掌握细菌的简单染色法。
3.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞非常小，又因为其含水量高
（一般在80％～90％以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差，所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算活菌外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别其构造。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
三、实验材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
2.染色剂：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、石炭酸复红染液。
3.仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。
四、实验步骤
1、涂片：取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于载玻片中央，用接种环以无菌操作（图3-1），分别从枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取1～2环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
2、干燥：室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
3、固定：如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。图 3-1 涂片、干燥和热固定。
4、染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。
5、水洗：倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
7、镜检：涂片干后镜检。涂片必须彻底干燥后才能用油镜观察，否则可能导致菌体脱落。
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图3-1 无菌操作示意图
图解：（1）将菌种斜面放在左手中指和食指之间，大拇指揿住试管。并使斜面向上，以便观察。
（2）右手转动棉塞，便于拔出。
（3）右手拿接种针，使其直立于火焰中，将接种针的电热丝部分烧红。
（4）用小指与手掌夹取棉塞。在拔棉塞时用力不宜过猛，以免将外界杂菌带入管内。还应该注意不要将棉塞和已烧过的接种针碰到物体上。试管也应保持水平位置，并在火焰附近。
（5）取出棉塞后，将管口均匀通过火焰。
（6）将接种针伸入菌种管内，先与斜面顶端的培养基接触，使其冷却，然后在斜面上挑取菌体。
（7）将管口均匀通过火焰，立即塞上棉塞。
（8）用过的接种针必须在火焰中灼烧后，才能放置它处，一是防止菌种污染环境，另外，还可以防止菌种间的交叉污染。
五、实验报告
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，标明视野，并注明其放大倍数和菌种类别。
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实验四细菌的革兰氏染色
一、实验目的
1．了解细菌的革兰氏染色法的原理。
2．掌握革兰氏染色法的主要步骤
二、实验原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的
重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram
创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅
能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌
区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为
革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈
红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，
用G－表示。细菌对于革兰氏染色的不同图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图
反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G－两大类群，常用的复染液是番红。
三、实验材料
1．菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2．染液：草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红液。
3．其他：显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。
四、实验步骤（见图4-2）
1、涂片：将培养14-16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2、染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约1分钟，水洗。
（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1分钟，水洗。
（3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20-30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染：用番红液染色1-2分钟，水洗。
（5）镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
图4-2 革兰氏染色的步骤
（6）检测：试利用上述方法，检测金黄色葡萄球菌的革兰氏染色反应的颜色。
注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。②被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的培养时间过长,或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应,所以被检菌的菌龄一般最好在18-24h之内。
五、实验报告
1.绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图,注明放大倍数及颜色。
2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
3.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
5.如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?
6.你的实验结果与课本中所述是否一致?如不一致,试分析原因。
实验五细菌的荚膜染色
一、实验目的
学习和掌握荚膜染色的方法，观察和了解细菌的荚膜形态。
二、实验原理
荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的分泌于细胞壁外的粘液状物质。其主要化学成分是水和多糖类物质。荚膜的折光率低、与染料的亲和力差，不易着色。通常采用负染色方法，即：使菌体和背景着色，而荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不用热固定或微热固定，以免荚膜皱缩变形。
三、实验材料
1．菌种：褐球固氮菌、肠膜状明串珠菌。
2．试剂：墨汁、番红染色液、6%的葡萄糖液。
3．其他：显微镜、载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。
四、实验步骤
1、制片：在载玻片一端加一滴6%的葡萄糖液，取少许培养72小时的褐球固氮菌或肠膜状明串珠菌与其充分混合，再滴一滴墨汁，混匀。左手执载玻片，右手拿另一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘置于菌液前方，然后稍向后拉，当接触菌液后，轻轻地向左右移动，使菌液沿着推片接触后缘散开，以30度角迅速而均匀地将菌液推向玻片另一端，使菌液涂成一薄膜。风干。
2、染色：加番红染液或墨汁与标本上，30s后，用细水流适当冲洗。
3、干燥、镜检。
五、实验报告
1．绘图，注明各部分的名称与颜色，并注明放大倍数。
实验六细菌的芽孢染色法
一、实验目的
学习和掌握细菌的芽孢染色法，观察和了解细菌的芽孢形态。
二、实验原理
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低、不易着色，若用一般染色法，只能使菌体着色，而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色，而一旦染上后，又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使得菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
三、实验材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌。
2.染料：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。
3.其他：显微镜、载玻片、试管夹、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯等
四、方法与步骤
1、将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌做涂片、干燥、固定。
2、将孔雀绿染色液滴加3-5滴于已固定的涂片上。
3、用试管夹夹住载玻片在火焰上加热，使染料冒蒸汽但不沸腾，切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约5-7分钟。
4、倾去染色液，等玻片冷却后，水洗至孔雀绿不再退色为止。
5、用番红染色液复染1-3分钟。
6、水洗吸干。
7、镜检。
五、实验报告：绘图，注明各部分的名称与颜色，并注明放大倍数。
一、实验目的
1．学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；
2．初步了解放线菌的形态及其菌落特征。
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏染色为阳性的原核微生物，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝和孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横隔分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。
放线菌的菌落早期绒状，同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。
三、实验材料
1．菌种：细黄链霉菌、青色链霉菌、弗氏链霉菌。各菌种早期和晚期的培养平板。
2．培养基：灭菌的高氏Ⅰ号琼脂培养基。
3．染料：石炭酸复红染液、吕氏美兰染液。
4．其他：培养皿，玻璃纸，盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，显微镜等。
四、操作步骤
（一）放线菌形态的观察
1．扦片法：在高氏Ⅰ号琼脂平板上划线接种，以无菌操作将灭菌的盖玻片以45o扦入琼脂内，倒置28℃培养3～5d后直接镜检,观察气生菌丝和孢子丝的形态。
2．玻璃纸法：将已灭菌的玻璃纸片铺在培养基平板上，压平玻璃纸后接种，倒置28℃培养3～5d后直接镜检。
3．印片法：接种培养后，将平板上的菌苔连同培养基切下，菌面朝上放在载玻片上。另取一载玻片盖在菌苔上，按压（印片用力要轻）、火焰固定后再用石炭酸复红染色液染色lmin，镜检。
（二）放线菌菌落特征的观察
分别观察早期和后期的菌落特征。
四、注意事项
1．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。
2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，
3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。
五、实验报告
1.将观察结果绘图，并注明各部位的名称。
2．试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。
3．镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
4．分别描述观察到的早期的和后期菌落形态。
一、目的要求
1．掌握霉菌的标本制作方法。
2．观察四类常见霉菌的基本形态和菌落特征。
二、实验原理
霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形；具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。
霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察，此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。
观察根霉时，注意观察其菌丝，无横隔，假根，孢子囊柄、囊轴、囊托、孢囊孢子及厚垣孢子。
观察毛霉时，注意观察其菌丝，无横隔，孢子囊柄、囊轴、孢囊孢子及厚垣孢子。
观察曲霉时，注意观察其菌丝，有横隔，足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗，分生孢子的着生情况。
观察青霉时，注意观察其菌丝，有横隔，分生孢子梗，帚状枝、分生孢子的着生情况。
三、实验材料
1．菌种：曲霉、青霉、根霉和毛霉培养2～5d的马铃薯琼脂平板培养物和玻璃纸培养物。
2．培养基：马铃薯葡萄糖培养基或查氏培养基。
3．染料：乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4．其他：无菌吸管，培养皿，载玻片，U形玻棒、盖玻片，玻璃棒，接种环，滤纸、解剖针，
解剖刀，镊子，20％的甘油以及显微镜等。
四、操作步骤
1．一般观察法
于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。
2．载玻片观察法
(1)将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1．05kg/cm2，121．3℃灭菌20分钟或干热灭菌，备用。
(2)将6-7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌培养皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0．5-1cm2的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。
(3)用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。
(4)在培养皿的滤纸上，加无菌的20％甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28℃培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。
3．玻璃纸透析培养观察法
(1)向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。
(2)用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。
(3)用1ml无菌吸管吸取0．2ml孢子悬液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。
(4)置28℃温室培养48小时后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。
五、实验报告
1.绘出所观察到的各种霉菌的形态图，注明各种结构的名称。
2.你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？
3.你是否成功的完成了第2和3的实验？若没完成，试分析原因。
实验九酵母菌的形态和菌落特征观察及死活鉴定
一、实验目的
1.观察酵母菌的形态和菌落特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。
2.学习鉴别死活细胞的实验方法。
二、实验原理
酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美蓝是一种毒性很低的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
酵母菌的菌落与细菌有一定相似，湿润、光滑、有一定的透明度，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘，中央部位的颜色都很均一等特点。
三、实验材料
1.菌种：酿酒酵母。
2.染料：0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。
3.其他：显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。
四、实验步骤
（一）美蓝染色液水浸片观察
1、在载玻片中央加一滴0．1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
2、用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。
3、将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
4、染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。
5、用0．05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。
（二）水一碘液水浸片观察按照上述方法进行操作。
五、实验报告
1. 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态和菌落特征。
2．吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。
3. 美蓝染色液和水一碘液对酵母菌的活性影响是否一致，为什么？
4．你认为在显微镜下，细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的主要区别是什么？
实验十微生物细胞大小测定与显微直接计数法
一、实验目的
1.了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。
2.了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（中方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。每个中方格的体积为1/250 mm3 (25个中方格)或1/160 mm3（16个中方格）。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mL=1cm3= 1000mm3
所以：1mL体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数=4×106。
1mL体积应含有中方格数为：1000mm3/1/250mm3=2.5×105或1000mm3/1/160mm3=1.6×105
因此：1ml菌悬液中含有细胞数= 每个小（中）格中细胞平均数×相应的系数×菌液稀释倍数。
三、实验材料
1.菌种：酿酒酵母、枯草杆菌染色标本片。
2.仪器和用品：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、移液器、香柏油、二甲苯、盖玻片等。
四、实验步骤
1.微生物大小的测定
（1）目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm
用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
（2）微生物细胞大小的测定
1）将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）
2）取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
3）移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。
2.微生物的显微计数
（1）稀释样品：加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。
（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
（3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
微生物学实验指导大全
微生物学实验指导 黄文芳张松编著 华南师范大学生命科学学院 第一部分基础实验 实验1 培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。 2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6 1．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3．调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
《微生物学实验》操作步骤
实验一培养基的制备与灭菌 实验步骤： （一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用） 每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。 （二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。 （三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。 培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。 配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。 培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。 （四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用） 每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。 （五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用） 枯草样预处理：每组1瓶。100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。 （六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
微生物学开放实验讲义
实验一糯米甜酒的酿制 一、实验目的 学习和掌握酒曲发酵糯米配制糯米甜酒的方法。 二、实验材料和用具 酒精发酵培养基、甜酒曲、蒸馏水、无菌水、糯米。 铝锅、电炉、三角瓶、牛皮纸、棉绳。 三、操作步骤 1. 甜酒培养基制作称取一定量优质糯米(糙糯米更好)。用水淘洗干净后，加水量为米水比1：1，加热煮熟成饭。或者糯米洗净后，用水浸透，沥干水后，加热蒸熟成饭，即为甜酒培养基。 2．接种糯米冷却至35℃以下，加入适量的甜酒曲(用量按产品说明书)并喷洒一些清水拌匀，然后装入到干净的三角瓶中或装入聚丙烯袋中。装饭量为容器的l/3～2/3，中央挖洞，饭面上：再撒一些酒曲，塞上棉塞或扎好袋口，置25～30℃下培养发酵。 3．培养发酵发酵2d便可闻到酒香味，开始渗出清液，3～4d渗出液越来越多，此时，把洞填平，让其继续发酵。 4．产品处理培养发酵至第7d取出，把酒槽滤去，汁液即为糯米甜酒原液，加入一定量的水。加热煮沸便是糯米甜酒，即可品尝。 四、注意事项 酿制糯米甜酒时糯米饭一定要煮熟煮透，不能太硬或夹生；米饭一定要凉透至35℃以下才能拌酒曲，否则会影响正常发酵。 五、实验报告 记录酵母酒精发酵过程，比较两种培养方法结果的不同，并解释其原因。 记录糯米配制糯米甜酒的发酵过程，以及糯米甜酒的外观、色、香、味和口感。 六、问题和思考 为什么糯米饭温度要降至35℃以下拌酒曲，发酵才能正常进行？糯米饭一开始发酵时要挖个洞，后来又填平，这有什么作用? 实验二乳酸发酵与乳酸菌饮料 一、实验目的和内容 目的：学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。 内容：1．从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化。 2．乳酸发酵及检测。 3．乳酸菌饮料制作。 4．自制乳酸质量品尝。 二、实验材料和用具
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的操作以及微生物的形态观察 一、实验目的 （一）了解光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 （二）观察细菌的个体形态，学会生物图的绘制。 （三）掌握压滴法制作标本的方法。 （四）通过显微镜观察，认识细菌的基本形态及特殊结构。 二、实验仪器、材料 光学显微镜，目测微计、物测微计，香柏油、二甲苯，擦镜纸、吸水纸，细菌、示范片，活性污泥混合液等。 三、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 （一）显微镜的结构（图1）和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1．机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为160 mm）和后倾斜式（倾斜45o）。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。 （2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 （3）载物台：载物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。 （4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。 （5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 （6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2．光学系统及其光学原理 1
微生物学检验实验指导
微生物学检验实验指导 2009．7 一、《微生物学检验》实验目的要求 1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。 2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。 3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。 4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。 二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法 1．微生物学实验室规则 由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。 （1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。 （2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。 （3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。 （4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。 （5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。 （6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。 （7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。 （8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。 2．实验室意外的紧急处理方法 （1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。 （2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处
(完整版)微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化 本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容,在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候,不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后,能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求 1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法. 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术. 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件. 二、原理 培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围.根据研究目的不同,可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8％的琼脂.有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外,还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
微生物学实验教程
微生物学实验内容 实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色 实验二 . 细菌的革兰氏染色 实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 实验四 . 酵母菌的数量测定 实验五 . 酵母菌的大小测定 实验六 . 微生物菌落的观察实验 实验七 . 霉菌的形态观察 实验八 . 培养基的制备与灭菌 实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察 实验十 . 微生物的纯种分离培养 实验一 . 普通光学显微镜的使用 一、目的要求 1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α 式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120度，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长 0.55μm来计算，数值孔径通常在 0.65 左右的高倍镜只能分辨出距离不小于 0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2μm左右。 三、器材 1. 菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片标本。青霉（Penicillium sp. ）的水封片。 2. 溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四 . 操作步骤 1. 观察前的准备 （ 1 ）显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4cm 。镜检时姿势要端正。 取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。 （ 2 ）光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 （ 3 ）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。 （ 4 ）聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种
微生物学实验
微生物学实验 引言 微生物学实验是研究微生物的种类、特性和功能的重要手段。通过实验可以深入了解微生物的生长、代谢、分化和遗传等方面的现象，为研究微生物的应用和控制提供理论和实践依据。本文将介绍微生物学实验的基本步骤和常用实验方法，并结合具体案例展示实验的设计和分析方法。 实验步骤 样品采集与处理 首先，需要选择合适的样品。可以从环境中采集，如土壤、水源等，或者从生物体中获取，比如人体、动物或植物组织。采集样品时要注意卫生和无菌操作，以避免污染。 采集到样品后，需要进行处理。常见的处理方法包括稀释、均质和过滤。稀释可以使样品中的微生物浓度适合进行后续操作，均质可以使样品中的微生物均匀分布，过滤可以去除较大的颗粒和杂质。
培养微生物 接下来，需要将样品中的微生物进行培养。培养微生物的方法有多种，常见的包括固体培养和液体培养。固体培养常用琼脂（Agar）作为培养基，液体培养则需要选取合适的培养液，并提供适当的温度、湿度和氧气条件。 在培养微生物的过程中，需要注意消毒操作，以防止其他微生物的污染。此外，还需要定期观察和记录微生物的生长情况，包括菌落形态、颜色和大小等。 鉴定与分离 当微生物培养达到一定程度后，可以进行鉴定和分离。鉴定微生物的方法有多种，包括形态学观察、生理生化检测和分子生物学技术。通过这些方法可以确定微生物的种类和相关特性。 分离微生物时，可以使用稀释涂布法、均匀涂布法或罩盖涂布法。将培养物均匀地涂布在琼脂平板上，然后进行孔明法或拭子转接法进行分离。分离出来的单个菌落可以进行单菌种的培养和纯化。
实验分析 最后，可以对微生物进行实验分析。根据研究目的，可以选择适当的实验方法进行。常见的实验分析包括微生物生长曲线分析、代谢产物检测、抗生素敏感性测试等。 微生物生长曲线分析是研究微生物生长规律的重要方法。可以通过测量菌落数量、菌落直径或光密度等参数，绘制生长曲线，并分析生长速率、生长周期等指标。 代谢产物检测可以了解微生物在不同条件下产生的代谢产物。常见的方法包括色谱法、质谱法和酶联免疫吸附法等。 抗生素敏感性测试可以评估微生物对抗生素的抗性。常见的方法有纸片扩散法和肉汤稀释法等。 案例分析：大肠杆菌的培养和鉴定 以大肠杆菌为例，介绍微生物学实验的具体步骤和分析方法。 1.样品采集与处理：从环境中采集水样，使用过滤器 过滤处理，去除悬浮物和杂质。
微生物学实验教案
微生物实验室守则 微生物学实验课是一门操作技能较强的课程。为保证实验顺利进行和实验操作者的安全，培养学生独立分析问题和解决问题的能力，达到训练学生掌握基本操作技能、验证理论知识的目的，所有参加实验的老师和学生都应严格遵守以下实验守则。 1、每次试验前必须充分预习实习指导，了解实验的目的、原理和方法。初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。 2、为保证实验台面的整洁和实验顺利进行，非本实验必需的物品（包括帽子围巾等）请放在指定地方，不影响实验操作。 3、实验室内严禁吸烟，进食、饮水，也不可将零食等带入室内。 4、进入实验室应穿工作服，离开时脱去，并经常洗涤保持清洁。 5、实验进行时，应尽量避免在实验室内走动，减少尘土飞扬。禁止高声谈话，保持室内安静。 6、实验时要细心谨慎，严格按操作规程进行，凡需进行培养的材料都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，并在规定时间内认真进行结果观察，以实事求是的科学态度做好实验记录，并及时提交实验报告。 7、节约药品、器材和水电。各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置妥当。实验完毕后，整理和擦净台面。离开实验室之前关闭水、电、门窗等，并用肥皂洗手。 实验一玻璃器皿的准备及常用仪器的使用 [目的] 系统掌握玻璃器皿的准备方法及常用仪器的使用。 [原理] 使用 无害处理 灭菌
洗涤 包扎 一、玻璃器皿的无害处理： 1、新购置的玻璃器皿因含有游离碱，一般在2%的盐酸溶液中浸泡数小时后再用清水洗净，也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗净。 2、常用玻璃器皿洗涤时可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗干净。 3、带油污玻璃器皿先将倒空的玻璃器皿用10%的氢氧化钠浸泡半小时或放在5%的苏打液内煮两次，去掉油污，再用洗衣粉和热水刷洗。 4、带菌玻璃器皿经121℃高压蒸汽灭菌20min后，趁热倒去内容物，再用洗衣粉水刷洗干净，以水在内壁均匀分布成一薄层而不出现水珠为油垢除尽的标准。 经以上处理的玻璃器皿，可满足一般实验用。少数实验对玻璃器皿清洁度要求较高，除用上述方法外，还应先用２％的HCl溶液浸泡数10min,再用自来水冲洗，蒸馏水淋洗2-3次。有的尚需超纯水淋洗然后烘干备用。 二、玻璃器皿的包扎：吸管、平皿、瓶口等的包扎 三、玻璃器皿的灭菌：分为两种，高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。 高压蒸汽灭菌法是湿热灭菌中应用最为广泛的一种方法。其原理是依据在一个密闭的高压蒸汽灭菌器中，水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。把待灭菌物品放在灭菌器内，当灭菌器内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20min,即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。一般的培养基、玻璃器皿、金属用具、实验服、传染性标本等均可用这种方法有效灭菌。灭菌的温度及时间视灭菌物品中的微生物种类及数量而定。 干热灭菌法也叫热空气灭菌法。实验室通常使用恒温控制的电热鼓风干燥箱作为干热灭菌器。此法常用于空的玻璃器皿、金属器具和其他耐高温的物品（如陶瓷培养皿盖、石蜡油、碳酸钙）的灭菌。其优点是灭菌器皿保持干燥。但带有胶皮、塑料的物品、液体及固体培养基不能用此法。干热灭菌一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准，160-170℃，2-3h方可杀死细菌的芽孢。 [实验材料] 吸管若干、平皿5付、盐水瓶1个、中试管、小试管、脱脂棉、纱布等
微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编 重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日 前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1.教学要求
1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向； 2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象； 4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。 2.教学方法 1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示； 2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有 机结合； 3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思； 4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。 三. 教学学时分配与安排 本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。 目录 实验一细菌的革兰氏染色 (3) 实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)
微生物学的实验技术和研究方法
微生物学的实验技术和研究方法微生物学是一个涉及微观生命领域的学科，对人类和自然界的生态环境有着重要的意义。微生物可以是细菌、真菌、病毒等单细胞或单核细胞生物，其中很多都是人类健康和生产活动的重要影响因素。微生物学的实验技术和研究方法不仅能够探索微生物在生态环境中的行为，还可以深入研究微生物与我们生活息息相关的各种人类疾病的原因和治疗方法。 一、培养技术 细菌和真菌需要特定的培养基，在特定的物理、化学条件下生长。例如，一般的培养基是TSB（液体），TSA（固体），这些培养基有不同功效，包括适合以某种特定生长方式的菌种和提供菌体所需的某些蛋白质和营养物质等。在实验室中，通常使用灭菌技术来保持培养基的无菌。使用灭菌设备，例如高压灭菌器和自动化微生物分类器等，可以使得微生物得到安全且正确地运作和增殖。 二、生物分子技术
生物分子技术是微生物学实验中常用的手段，它包括PCR技术、DNA测序、RNA干扰等多种方法。PCR技术可以制造大量重复的DNA序列，使得细胞的DNA更容易提取和研究；同时，PCR技 术还可以检测病原菌的存在和确定病原菌的DNA序列。DNA测 序技术还可以揭示菌群之间的变化和在不同环境中的分布情况， 这对理解微生物生态学是非常必要的。 三、细胞生物学技术 细胞生物学技术可以揭示微生物与宿主的互动方式。例如，一 个流行病学家可以标记病毒，并研究它在宿主体内的移动行为。 细胞生物学技术中，光镜、电镜等显微镜技术成为不可或缺的工 具之一，可以让研究者们研究细菌或病毒在单一细胞和群体层面 的行为和互动效应。在使用显微镜的过程中，需要控制自由游动 的细胞，并使其可以在碳涂片上留下显著的痕迹，从而定量研究 其行为。 四、流式细胞分析技术 流式细胞分析也是微生物学中常用的实验技术之一。通过该技术，可以将微生物群体的重要特征分类、定量和解析，例如大小、
医学微生物学与免疫学实验
医学微生物学与免疫学实验 实验一微生物的形态学检测（2学时） 实验二理化因素对微生物的影响（2学时） 实验三肠道致病性细菌的分离与鉴定（4学时）实验四抗酸染色（2学时） 实验五寄生虫学实验（2学时）
微生物与寄生虫学实验 序言 本实验在于使学生加深与巩固课堂内容，并在掌握系统理论知识的基础上，学习微生物与寄生虫学的基本操作技能，通过实验加强无菌概念，培养独立工作与分析问题的能力，为今后有关的疾病诊断与中医中药的科学研究工作打下良好的基础。 本实验指导共包含五个试验项目，共计教学12学时，按教学计划及大纲要求供我院中医学专业、针灸推拿专业、骨伤学专业、护理学专业、中西医结合等专业学生使用。
实验室规则 本门学科实验的对象大多是病原微生物，假如不慎发生意外，不仅自身可能遭致感染，并有可能将病原微生物传给他人。因此，进入实验室务必遵守下列规则： 1. 非实验必需物品，不准带进实验室。 2．进入实验室务必穿工作服，按规定就座，保持肃静。 3．上实验课要严格遵守课堂纪律，不得高声谈笑及乱动物品，禁止吸烟与进食。 4．实验时听从老师指导，牢固树立无菌观点，严格遵守无菌操作规程，若发生菌液污染，损坏物品等事故，应立即报告老师及时处理。 5．实验中用过的染菌器材如吸管，试管与用过的玻片等应及时放人含有消毒液的容器内，不得放在桌上，也不可在水槽里冲洗。6．爱护公物，节约使用实验材料；注意安全使用水、电、煤气。7．实验完毕，按要求整理器材物品，打扫卫生。脱下工作服，消毒洗手后，离开实验室。 8．作业应在规定时间内完成，实验报告要求简洁扼要，字迹清晰，画图力求正确、客观。
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 2。蛋白酶产生菌的分离与纯化 2。1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化. 2。2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。 2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 2。4 实验方法与步骤 2。4.1 分离 1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液； 2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌； 3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h； 4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 2。4。2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。 2.5 实验结果 在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。 1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2)报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值)结果。
环境微生物学实验指导书
实验一显微镜的原理及其使用方法 一．目的 1、学习普通光学显微镜的基本原理 2、学习掌握光学显微镜的使用方法 3、结合实验室提供的实验装片观察微生物的形态，并学习测量微生物大小的方法 二、实验器材 1、微生物实验装片 2、显微镜、目镜测微尺、物镜测微尺（镜台测微尺）、载玻片，盖玻片等 三、实验步骤 （一）显微镜的结构和各部分的作用 其构造包括机械和光学两部分。 机械部分主要包括： 1、镜筒镜筒长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装 有三个接物镜。 2、载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹 簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。 3、调节器镜筒内旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调 节接物镜与所需观察物体之间的距离。 光学部分主要包括 1、接目镜一般使用的显微镜具有2~3个接目镜，其上常刻有“5×”或“10×”或“15 ×”等数字及符号，表示使用时可以放大5倍，10倍，15倍。观察微生物时常用10倍或15倍的接目镜。 2、接物镜接物镜装在回转板上，可分低倍镜，高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常 是10、40（或45）100（或90）。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如，用放大40倍的接物镜与放大10倍的接目镜所得的物象的放大倍数为400，如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为40×15=600。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。 油镜的放大倍数最大（90或100）。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，所以自标本玻片透过的光线，因介质密度（从玻片至空气，再进入油镜）不同，有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使进入个别光线过少，物象显现不清楚，所以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率相仿的镜油。因为这种接物镜使用是要加镜油，所以我们叫它油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油所以我们叫它干镜。 使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体的观察，不进行染色。在观察细小动物时，低倍镜主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态，而高倍镜则可以看出动物的结构特征，低倍镜容易看到物体的全貌，油镜在大多数情况下使用来观察染色的涂片。 3、集光器集光器在载物台的下面用来集合由反光镜反射来的光线。它可以上下调整，中 央装有光圈，用以调节光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。 4、反光镜装在显微镜的最下方，有平凹两面，可自由转动方向，以反射光线至集光器。（二）显微镜使用和保护的方法 1、低倍镜的使用法 （1）置显微镜于固定的桌几上，窗外不宜有阻碍视线之物。
17-食品微生物学实验指导手册.
《食品微生物学》实验指导手册
目录 实验一环境中微生物的检测 (1) 实验二细菌的革兰氏染色 (3) 实验三细菌的芽孢染色 (5) 实验四霉菌水浸标本片的制备与观察 (7) 实验五牛奶中菌落总数的测定技术 (8) 实验六食品中金黄色葡萄球菌的测定 (11) 实验七国标法测定食品中的大肠菌群 (14) 附录1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 (16)
实验一环境中微生物的检测 一、实验目的 1．学习环境中微生物的检测方法。 2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。 二、实验原理 自然环境中普遍存在着各种各样的微生物，检测微生物的存在，简单的方法是应用一般营养琼脂，使微生物细胞或其孢子落到营养琼脂表面，在适宜温度下即可大量繁殖，形成肉眼可见的群体——菌落。不同微生物各自具有不同的菌落形态。 三、实验仪器与材料 1．培养基： 营养琼脂平板（NA）： 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。 制法：将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121℃，15min高压灭菌备用。 马铃薯葡萄糖琼脂平板（PDA）： 成分：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000mL。 制法：pH值自然。将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000mL 蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000mL，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121℃灭菌20min。另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000mL 培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。 2．仪器用具：恒温培养箱、记号笔 四、实验步骤 1、取营养琼脂、PDA平板各一个，在皿盖上用记号笔标明班级、姓名及编号。 2、分别打开皿盖，做如下处理： （1）置实验台上，于空气中暴露5分钟。 （2）置地面上，脚击地板，于振动的空气中暴露5分钟。 （3）用自己的手指分别触摸平板（轻按即可）。 （4）呼出气体于平板上。 3、把经以上处理的平板分别盖上皿盖，将培养皿倒置于恒温培养箱内培养，营养琼脂平板置于37℃培养箱中培养48h，PDA平板置于28℃培养箱中培养2-3天后检查结果。 五、思考题
微生物学实验指导
微生物学实验指导 00 微生物学是现代生物学科的先头学科,是科学技术现代化和农业现代化的重要学科领域 之一，就其学科性质而言它又是一门实践性很强的学科。 实验课的教学目的是训练学生掌握微生物学最基本的实验操作技能，了解微生物学的基 本知识，加深理解课堂讲授的微生物学理论知识，同时，通过实验培养学生观察、思考、分 析问题和解决问题的能力；实事求是，严肃认真的科学态度；为以后课程的学习和将来的工 作以及科学研究打下坚实的基础。 本实验指定是在参考有关院校的微生物学实验教材的基础上，结合我们的实验室条件以 及仪器设备状况，经过多方取舍编写而成，可供生物技术及畜牧兽医等专业师生参考。 由于编者水平有限，加上时间仓促、经验不足，在许多方面肯定有不少缺点与错误，希 望各位读者批评指正。 在编写过程中，龙岩学院生物系全体师生给予大力支持，在此表示感谢。 编者 2006.10
实验一显微镜的使用 ............................................... 1 实验二微生物染色法 ............................................... 4 实验三培养基的配制和灭菌 ......................................... 9 实验四霉菌和放线菌的形态观察 (11) 实验五微生物细胞数量的测定 ...................................... 14 实验六药物敏感试验 . (18) 实验七糖发酵试验 ................................................ 21 实验八牛乳中细菌的检查 .......................................... 23 实验九校园环境空气微生物的调查 (26) 实验十病毒的鸡胚培养 (28) 实验十一病毒的血凝及血凝抑制试验 ................................ 30 实验十二菌种保藏 (31) 附录 ............................................................. 40 1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。 2、了解油镜的原理，并掌握其使用方法。 3、学习悬滴法观察细菌的运动性。 普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、 镜筒、 载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接 目镜、
微生物学实验教程
Ⅰ、微生物学实验室常用的器皿 微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。 一、器皿的种类、要求与应用 1．试管（test tube） 微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。 （1）大试管（约18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。 （2）中试管（约13—15×100—150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。高等医学院校实验教材 医学微生物与免疫学 实验指导 主编韩莉 副主编张昌菊宋利琼
编者 (以姓氏笔画为序) 王磊朱平刘嘉刘英 宋利琼吴红艳杨建林周永芹 张颖张昌菊韩莉 三峡大学医学院生物病原部 2005年6月29日 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 31 目录 第一篇医学微生物学 实验室规则 (2) 实验一常见细菌形态学检查方法(综合性实验) (3) 实验二细菌的分离培养法与消毒灭菌(综合性实验) (11) 实验三化脓性球菌的分离鉴定(设计性实验) (27) 实验四肠道杆菌的分离鉴定(设计性实验) (32) 实验五厌氧菌,分支杆菌的检查法(综合性实验) (41) 实验六各种微生物形态,病毒学检查法(综合性实验) (46) 微生物学各论自学提纲 (56) 第二篇医学免疫学 实验一天然免疫功能的检测(综合性实验) (60) 实验二常见抗原抗体反应(综合性实验) (67) 实验三细胞免疫检测I:细胞因子的检测(设计性实验) (86) 实验四细胞免疫检测Ⅱ:淋巴细胞分离,计数及活性检测(设计性实验) (94) 实验五细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖实验(设计性实验) (103) 综合复习 (107) 附录 (113) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software
《微生物学及实验》实验指导书
《微生物学及实验》实验指导书 第一部分 实验目的 《微生物学及实验》实验课是我院情况科学专业学生必修的一门重要的底子实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。 《微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的根本实验要领和技能，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中创建无菌观点和掌握无菌操纵技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的底子。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技能的根本操纵和技能训练，培养学生动手操纵能力和创新能力。通过微生物学实验课讲授，加深理解和牢固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的根本操纵技能，了解微生物实验的底子知识。通过微生物学实验培养学生视察、思考、阐发问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。 本实验指导书主要内容包罗：微生物个别和菌落形态视察、染色要领、培养基制备和灭菌、无菌操纵、微生物检测和疏散、生理生化反响、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物漫衍视察等内容。同时也注意和情况微生物学的联系与区别。 整个实验课中贯串了显微镜使用—灭菌要领—无菌操纵—微生物菌种疏散筛选判定、选育—微生物代谢作用这一主线。微生物学需掌握的根本操纵在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学根本观点的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下： 序 号 实验名称 学时 实验类型 实验一 光学显微镜的使用及活性污泥中生物相的视察 3 底子验证实验 实验二 微生物的染色及视察 3 实验三 培养基的制备和灭菌 3 实验四 纯种微生物的疏散、转种和培养 3 实验五 有机污染物质的生物降解实验* 4 综合性实验 实验六 双歧杆菌口服液的发酵制备* 4 *注：实验六为选做实验。