(完整版)微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化
本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容,在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候,不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后,能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。
一、目的要求
1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法.
2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术.
4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件.
二、原理
培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围.根据研究目的不同,可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8％的琼脂.有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。
由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外,还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
灭菌的方法很多，最常用的是加压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在每平方厘米为一个大气压（即15磅/时2）的压力下，温度可达121℃，一般只要持续15～20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子.
由于加压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物的，所以，该法只有当灭菌锅内的空气完全排尽后，才能达到最佳效果。
土壤是微生物生活的大本营,是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些.本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌.
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性,避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时,一般在制备土壤稀释液时添加10%的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25～50 u/ml以抑制细菌；添加制霉菌素50 u/ml或多菌灵30 u/ml 以抑制霉菌）。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH 7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。
三、试验材料
1．药品:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、麦芽汁、氢氧化钠
2．其它：试管、三角瓶、移液管、烧杯、量筒、玻棒、漏斗、纱布、棉花、牛皮纸、天平、PH
试纸、马铃薯干、高压蒸汽灭菌锅。
3无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒（刮刀）、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。四、试验方法与步骤：
(一) 玻璃器皿的准备培养基的配制消毒灭菌
1．根据实验需要，准备各种玻璃器皿,洗刷干净，用报纸包扎好，进行干热灭菌。需要什么，需要多少，各实验组要认真核算，否则影响实验进程。
2．培养基的配制：
（1）称药品：根据配方，计算出试验中各种药品所需要的量，然后分别称取。
(2）溶解: 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加入少于所需要的总体积的水进行加热溶解(但在配置化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀,故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想）。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，,补足水分到需要的总体积。
（3）调节PH：用滴管逐滴加入1N的NaOH，边搅动，边用精密的PH试纸测其PH值，直到符合要求时为止.PH值也可用PH计来测。
（4)过滤：要趁热用四层纱布过滤。
（5）分装：按照实验要求进行分装.装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口，以免弄湿棉塞，造成污染.
培养基的分装装置见图
（6）加塞：培养基分装好以后,在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证优良还得通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形与未开伞的蘑菇相似,其大小、松紧都应适当。
加塞时，棉塞总长度的3/5应在口内，2/5应在口外.
作棉塞的棉花要选用纤维较长的，一般不用脱脂棉作棉塞，因为它容易吸水变湿,造成污染，而且价格也较贵。
棉塞的一般制作方法可参见图
如果培养基在短期内使用，不用棉塞，直接套上一只铝质试管帽也可试管帽是通过互相交叉的弹簧丝来控制与试管的松紧度。它的外形、构造如图
在微生物实验或科研工作中，常常要用到通气塞。所谓的通气塞就是用几层纱布（一般是六至八层）做成的、通气性能更加良好的塞子。通气塞加在装有液体培养基的三角烧瓶瓶口上，放在摇床上进行振荡培养，可获得更多的氧气来促进菌体生长或进行发酵。它的形状如图
（7）包扎：棉塞塞好以后，试管用棉绳扎成捆.在棉塞的外面包上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水的沾湿和灭菌后的灰尘侵入。然后再用棉绳扎好，挂上标签，注明培养基的名称及配制日期。
（8）灭菌：一般情况下，培养基配好以后，应立即灭菌。如不及时灭菌，应放入冰箱内保存。（9)搁置斜面：灭菌后，固体培养基如需制成斜面,应在未凝固前将试馆有塞的一头搁在一根长的玻棒或木条上即可。搁置的斜度要适当。斜面长度一般以不超过时管长度的1/2为宜
3．培养基的灭菌:
（1）加水：直接往灭菌锅内加水约3升
（2）装料：将待灭菌的物品放在灭菌桶内。包于包之间留有适当的空隙，以利蒸汽的流通。（3)密封：将盖上的软管插入灭菌桶的槽内。上下对齐,拧紧螺栓,切勿滴漏气。
（4）升压：点燃煤气,加热至水沸腾,排尽锅内空气（可将排出的气体用橡皮管引至深层冷水中，如只听有“噗噗”之声而未见气泡逸出水面,表示锅内空气以排尽）.然后盖上放气阀，升压。
（5）灭菌：待压力达到一定时，关小煤气，使其恒压，并开始计算灭菌时间.
（6）降压：达到规定的灭菌时间后，关闭煤气,让其自然降压冷却。
(7）取料：待压力完全降至“零”后，打开放气阀，再松动螺栓,拿掉盖子，从灭菌筒内取出灭过菌的材料.
(8）倒水：灭菌锅用好以后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。
按照上面的步骤,参照教材，配置下列培养基，配制的量，同学们自己估算,要略有剩余，不能浪费。
A。配制营养琼脂培养基。
B.配制高氏一号培养基.
C。配制马丁氏培养基。
D.分装上述培养基与三角瓶和试管中，并包扎
E.将上述配置分装和包扎好的培养基进行高压蒸汽灭菌
（二) 土壤中细菌、放线菌、真菌的分离与纯化
1．细菌的分离
（1）制备土壤稀释液称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中,振荡10～20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10—2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离,以制备10—7稀释度为例，具体操作过程如下：取4。5ml无菌水试管6支,按10-3……10—7顺序编号，放置试管架上.取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口,将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头,将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夹在手上，不能乱放在桌上)，将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面)，然后准确吸取0.5ml 10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽
（或棉塞)，将0。5ml 10—2土壤稀释液注入4.5ml无菌水试管内，制成10—3的土壤稀释液,将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用.盖上试管帽,右手持10—3稀释液试管在左手上敲打20~30次,混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0。5ml 10-3的稀释液，置第二支装有4。5ml无菌水试管中，制成10—4土壤稀释液。用同法再制成10—5、10-6、10—7的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中,用3%～5％来苏尔浸泡1h后再灭菌洗涤。
（2）倾注法分离取无菌培养皿6～9个,分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10—7土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技术加到相应编号10-7的无菌培养皿内。再以相同方法分别吸取1ml 10—6、10-5的土壤稀释液,各加到相应编号为10-5、10-6的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化,待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10—5、10—6、10—7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意:温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多,也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平.倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入,倾入培养基约12～15ml，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上.整个操作过程见图
（3)培养待平板完全冷凝后,将平板倒置于37℃恒温箱中，培养24～48h观察结果。
2．放线菌的分离
（1）制备土壤稀释液称取土样1g，加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中,并加入10滴10%的酚溶液（抑制细菌生长），有时也可不加酚。振荡后静置5min,即成10—2土壤稀释液。
（2）倾注法分离按前法将土壤稀释液分别稀释为10-3、10—4、10—5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1ml 10-5、10—4、10—3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。
(3）培养冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d观察结果。
3．真菌的分离
（1)制备土壤稀释液称取土样5g，加入到一个盛有95ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中,振荡10min，即成10-2土壤稀释液.
(2)倾注法分离依前法将土壤稀释液再稀释成10—3、10-4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1ml 10-4、10-3、10-2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内.采用马丁培养基倾倒平板,为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马丁培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。
（3）培养冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。
（三）划线分离法
菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散,经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落,从而达到纯化目的.平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不
宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌（图6—1—4A）；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法.划线时每次将平板转动60～70°划线（见图6—1-4B）,每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线.
1．连续划线法
以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落(参见附录四微生物的接种技术)。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板,在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集,充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠(图6—1—4A,6-1—5）。划线完毕,关上皿盖。灼烧接种环,待冷凉后放置接种架上.培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）.培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
2．分区划线法（四分区划线法,图6—1—4B)
取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区,故又称四分区划线法.其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行,这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖,将平板转动60~70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源,由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线.划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。
本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板,倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。
五、复习思考题：
1．分析新配制培养基中，何为碳源，何为氮源？
2．如何检查灭过菌的培养基是否无菌？
3．培养基为什么要调整pH值？细菌、放线菌、酵母菌、霉菌生长最适pH值为多少？
4．根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌？它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系?
实验二微生物的染色
由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上),对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况,染色观察时必须注意.
一、染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等.化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是,要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生.相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷;而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合.所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色.
影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否,在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等,也都能影响细菌的染色。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到,其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料,多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水,而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水，通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性(复合）染料和单纯染料四大类。
1、酸性染料
这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等,可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时,细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。
2、碱性染料
这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色。
3、中性（复合）染料
酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料,如瑞脱氏(Wright)染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb)的染料。
三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可。
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些,可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3、固定
标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：
１)杀死微生物，固定细胞结构。
２)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉.
３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。
固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端）,标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次，共约2—3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。
以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%)，酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2％的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1-2％饿酸溶液,同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1-2分钟后把标本从培养皿中取出,并使之干燥.
4、染色
标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同,视标本与染料的性质而定,有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1-3分钟,而所有的染色时间内，整个涂片(或有标本的部分）应该浸在染料之中。
若作复合染色，在媒染处理时,媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。
５、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3％盐酸溶液.
６、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察.革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。
７、水洗
染色到一定的时候,用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。
８、干燥
着色标本洗净后，将标本晾干,或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。
９、镜检
干燥后的标本可用显微镜观察。
综上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。
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四、染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色,但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法.常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。
１、单染色法
用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下,细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。
单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤.
染色结果依染料不同而不同：
石碳酸复红染色液:着色快,时间短，菌体呈红色.
美兰染色液:着色慢,时间长，效果清晰,菌体呈兰色.
草酸铵结晶染色液：染色迅速,着色深,菌体呈紫色。
２、革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后,用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+）,后者为革兰氏阴性菌（G—）.为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应.
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应.此外，两类
菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大,易脱色。所以脱色时间,脱色方法也应严格控制.
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
１）涂片固定.
２）草酸铵结晶紫染1分钟.
３）自来水冲洗.
４)加碘液覆盖涂面染1分钟。
５）水洗,用吸水纸吸去水分。
６)加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分.
７)蕃红梁色液(稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥,镜检.
染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色
实验三微生物细胞大小测定和计数
Ⅰ、微生物细胞大小的测定
一、实验原理
微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺(图)是一块圆形玻片,其中央刻有精确等分的刻度，有把5毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100毫米。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺是处在目镜的隔板上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关,只要目镜不变，它就是定值。而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显
微镜下细胞的放大比例不同,只是代表相对长度,所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺(或血球计数板）校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。
二、实验器材
1、仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺或血球计数板
2、材料 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)标本片
目镜测微尺及其安装方法如图
三、操作步骤
1、目镜测微尺的校正 把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把血球计数板置于载物台上,使刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清血球计数板的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与血球计数板的刻度平行,移动推动器、使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后,仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和血球计数板的格数.因为血球计数板的刻度每格长50微米，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度:
格数两重合线间目镜测微尺格数两重合线间血球计数板目镜测微尺每格长度m
μ50⨯=
例如目镜测微尺10小格等于血球计数板2小格,已知血球计数板每小格为50微米则2小格的长度为2×50微米＝100微米，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为：
微米微米1010502=⨯
同法校正在高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
2、测定巨大芽孢杆菌细胞大小 换上巨大芽孢杆菌标本片，先在低倍镜下找到目的物,然后在油镜下转动目镜测微尺，测出巨大芽孢杆菌菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。
一般测量菌的大小要在同一个涂片上测定10—20个菌体,求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
四、注意事项
1、当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度.
2、不能用血球计数板对目镜测微尺在油镜下进行校正时，此时目镜测微尺每格相当于1
微米。
Ⅱ、微生物的显微镜直接计数法
一、实验原理
测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。
镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察.而血球计数板较厚，不能使用油镜,故细菌不易看清.
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台.中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数.计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图5)。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0。1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为
0。1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3.使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
图Ⅳ-2 血球计数扳的构造
a.平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）
b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
图Ⅳ-3 血球计数板计数网的分区和分格
二、实验器材
1、1、菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌液；
2、2、仪器显微镜，血球计数板；
3、3、材料盖玻片,吸水纸,尖嘴滴管。
三、操作步骤
1、视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10—2),以每小格的菌数可数为度。
2、取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。
3、将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多）,使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡,并用吸水纸吸
去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡)。
4、静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。
5、计数时用16中格的计数板,要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格（即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板.除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数（即80小格）。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏.如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线,数左线不数右线，以减少误差。
6、凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次（每次数值不应招差过大,否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数.
每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数
7、血球计数板用后,在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。
四、注意事项
1 加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡.
1、由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱性美蓝染液处理
酵母菌液。
实验四细菌的生理生化试验
一、目的
（一）了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理
（二）掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法
二、原理
微生物实验指导书
实验一普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察 一、实验目的 1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。 2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。 3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。 二、实验原理 普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。 图1-1 双目生物显微镜 1．机械部分： （1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。 （2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。 （3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。 （4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。 2．光学部分： （1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。 （2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（A N ）及所要求盖玻片厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。 （3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。 （4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。
微生物学实验指导大全
微生物学实验指导 黄文芳张松编著 华南师范大学生命科学学院 第一部分基础实验 实验1 培养基的配制 一、实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。 2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6 1．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3．调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
食品微生物学检验 霉菌和酵母计数作业指导书
食品微生物学检验霉菌和酵母计数 1、范围 本标准规定额食品中霉菌和酵母菌的技术方法。 苯标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数 2、设备和材料 除微生物实验常规霉菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2℃～5℃. 2.2恒温培养箱：28℃±1℃. 2.3均质器。 2.4恒温振荡器。 2.5显微镜：10×～100×. 2.6电子天平：感量0.1g。 2.7无菌锥形瓶：容量500Ml,250Ml. 2.8无菌广口瓶：500Ml。 2.9无菌吸管：1Ml,10Ml 2.10无菌平皿：直径90mm。 2.11无菌试管：10mm*75mm。 2.12无菌牛皮纸袋，塑料袋。 3、培养基和试剂 3.1马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基； 3.2孟加拉红培养基。 4、操作步骤 4.1样品的稀释 4.1.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1：10稀释液。或放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 4.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 4.1.3取1mL1:10稀释液注入含油9mL无菌水的试管中，另取一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。 4.1.4按 5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品的匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL 无菌吸管。 4.1.5根据对样品污染状况的估计，选择两个至三个适宜稀释度的样品匀液（液体样品包
括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL匀液于2个无菌平皿内，同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作为空白对照。 4.1.6及时将15mL～20Ml冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基倾注平皿。并转动平皿使其均匀。 4.2培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d,观察并记录。 4.3菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落单位CFU表示。 选取菌落数在10CFU～150CFUDE 平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的科技路为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 5、结果和报告 5.1 计算两个平板菌落数的平均值，在将平均值乘以稀释倍数计算。 5.2若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他屏蔽你可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 5.3若所有平板上菌落均小于10CFU，则应按稀释最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.4若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计算。 6、报告 6.1菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位数字报告。 6.2菌落数大于或等于100时，前三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数来表示结果；液可用10的指数数字来表示，此时也按“四舍五入”的原则修约，采用两位有效数字。 6.3称重取样以CFU/g为单位报告。提及取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
微生物学实验教案
微生物学实验实验项目名称和学时分配 序号实验项目名称学时 分配 实验属 性 实验类 型 实验者 类别 每组 人数 必开/ 选开 1 显微镜的使用和真菌形态的 观察 3 基础类验证性本科生必开 2 革兰氏染色法 3 基础类验证性本科生必开 3 酵母菌的形态观察及死活细 胞的鉴别 3 基础类验证性本科生必开 4 微生物大小的测定及计数 3 基础类验证性本科生必开 5 牛肉膏蛋白胨培养基的制备 3 基础类验证性本科生必开 6 土壤中细菌的分离纯化 6 基础类综合、 设计性 本科生必开 7 菌种保存 6 基础类综合、 设计性 本科生必开 合计27 说明：在上述12个实验中根据实验材料情况压缩合并成9个实验。 实验内容、要求和所用设备 1、实验内容 实验一显微镜的使用和真菌形态的观察 一、[目的要求] 熟悉普通光学显微镜各部分的结构和性能。 观察真菌的基本形态。 二、[实验原理] 1.光学显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 2.油镜通常标有“OI”或“HI”字样，有时也有用刻一圈红线或黑线为标记的。用不 同放大倍 数的目镜可使被检物体放大1000-2000倍。 三、[实验步骤] 1.调节光源
2.低倍镜观察 3.高倍镜观察 四、[实验报告] 1.实验结果 绘出所观察到的真菌形态，并注明物镜放大倍数和总放大倍数。 2.思考题 根据你的实验体会，谈谈如何根据所观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效观察。 实验二革兰氏染色法 一、[目的要求] 了解革兰氏染色的原理；掌握革兰氏染色的方法。 二、[实验原理] 根据革兰氏染色反应的结果，可将所有细菌分为两类：呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示； 三、[实验步骤]（插片法） 1.涂片 2.固定 3.染色 4.干燥 5.镜检 四、[实验报告] 1.实验结果 报告所观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图。 2.思考题 1.革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 2. 革兰氏染色成败的关键在哪一步？为什么？应如何掌握？ 实验三酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 一、[目的要求] 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、[实验原理]
微生物实验指导
二零零六年十月
目录 实验一显微镜油浸系物镜的使用 ------------------------------------------3实验二细菌形态的观察-------------------------------------------------------------4实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 ------------------------5实验四细菌的革兰氏染色---------------------------------------------------------7实验五细菌的芽胞染色 ------------------------------------------------------------8实验六酵母菌的形态观察实验 ---------------------------------------------- 10实验七霉菌的形态观察----------------------------------------------------------- 12实验八细菌大小的测定----------------------------------------------------------- 14实验九细菌数量的测定（血球板计数） ------------------------------ 16实验十培养基的配制--------------------------------------------------------------- 19实验十一消毒与灭菌--------------------------------------------------------------- 21实验十二稀释平板计数及微生物菌落形态的观察 -------------- 27实验十三紫外线对微生物生长的影响 ---------------------------------- 30实验十四抗生素对微生物的作用 ------------------------------------------ 30实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 ------------------------ 31实验十六土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法)33实验十七土壤中放线菌的分离与计数 -------------------------------- 35实验十八土壤中真菌的分离与计数 ------------------------------------ 36实验十九纤维素分解试验----------------------------------------------------------- 37
环境工程微生物实验指导书-图文
环境工程微生物实验指导书-图文 实验一光学显微镜的操作及细菌形态观察 1.1实验目的 (1)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 (2)观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。 1.2实验器材 显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。 1.3显微镜的结构及其操作方法 1.3.1普通光学显微镜(LightMicrocope)1.3.1.1光学显微镜的结构和各部件作用 观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系 统两部分。 一机械装置 (1)镜筒：镜筒长度一般是160cm。它的上端装目镜，下端装物镜回转板。回转板上一般有三个物镜。 (2)转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。
(3)载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光 线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。有的载物台上装有 自动推物器。 (4)调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。 二光学光学系统 （1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5某”、“10某”、“15某”(或“16某”) 等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。这三种透镜的 焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。 （2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜 三种。相应的放大倍数是10某（5某）、40某（50某）、100某（90某），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值 孔径（N.A）。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。 在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类和观察它的 活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。油镜在大多数情况 下是用来观察染色的涂片。 （3）集光器集光器在载物台的下面，用来集合反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，可以调整光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。 （4）反光镜反光镜装在显微镜的最下方，有平凹面反光镜。 1.3.1.2光学显微镜的分辨率与放大倍数
微生物学检验实验指导
微生物学检验实验指导 2009．7 一、《微生物学检验》实验目的要求 1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。 2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。 3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。 4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。 二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法 1．微生物学实验室规则 由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。 （1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。 （2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。 （3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。 （4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。 （5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。 （6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。 （7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。 （8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。 2．实验室意外的紧急处理方法 （1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。 （2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处
(完整版)微生物学实验指导书
实验一微生物的分离和纯化 本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容,在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候,不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后,能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求 1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法. 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术. 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术,了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件. 二、原理 培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围.根据研究目的不同,可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2％的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8％的琼脂.有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外,还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
微生物学实验指导书
微生物学实验指导书生物技术教学部初立业编 重庆邮电学院生物信息学院
2003年12月30日 前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1.教学要求
1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向； 2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象； 4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。 2.教学方法 1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示； 2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有 机结合； 3）根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思； 4）严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。 三. 教学学时分配与安排 本课程按每周3学时安排，共6个实验，总学时18。 目录 实验一细菌的革兰氏染色 (3) 实验二根霉、酵母菌形态结构的观察 (4)
微生物检验作业作业指导书.
微生物检验作业作业指导书.1000字 微生物检验作业作业指导书 一、作业目的 通过学生的自主调研，了解微生物检验的基本概念、方法、流程及 其应用领域，在此基础上，学习相关实验技能，并在实践中提高学 生的实验操作能力。 二、作业要求 1.选择一个与微生物检验相关的主题进行调研（如细菌检验、真菌 检验、病毒检验等），深入了解其基本特征、检验方法、检验流程 及其应用领域。 2.结合所学相关知识，了解微生物检验实验室的基本设备和实验条件，掌握相应的消毒、无菌操作和物品清洗等实验技能。 3.利用自己的调研和实验经验，撰写完成一份微生物检验实验报告。 三、作业步骤 1.主题选择。选择一个与微生物检验相关的主题或者问题，如“医 院细菌检验方法研究”、“河水中大肠杆菌检测技术分析”等。需 要注重主题的实际可行性，避免选择过于宏大或难以完成的主题。 2.调研文献。利用图书馆、网络等资源，收集与选定主题相关的文 献资料，包括学术期刊论文、专业书籍、技术资料等。建议访问一 些专业网站，如中国微生物学会、中国食品科学技术学会等网站， 获取最新的学术信息。 3.实验学习。根据选定的主题和文献资料，了解相关的实验方法和 流程，并在实验室中学习相关的实验技能。了解实验室的基本设备 和实验条件，掌握相应的消毒、无菌操作和物品清洗等实验技能。 需要注意实验过程中的安全问题，确保实验过程的有效性和安全性。 4.撰写实验报告。根据实验结果，撰写一份完整的实验报告。报告 内容应包括所选主题的研究背景、研究目的、实验方法和流程、实 验结果和分析、结论和建议等。需要注意报告的逻辑性和系统性，
确保表述准确、规范、清晰。报告中需要注重科学方法和实验数据 的稳定性和可重复性。 四、注意事项 1.作业选题要求实际可行性和可完成性，避免选择过于宏大或难以 完成的主题。 2.调研过程中要注意文献来源的可靠性和权威性，并及时更新最新 的学术信息。 3.实验过程中要注意安全问题，严格遵守各项实验操作规程和安全 操作程序。 4.撰写报告时要注意逻辑性、系统性和准确性，避免主观臆断或数 据错误等误导读者。 5.最后，要遵守学术道德和规范，确保实验过程的有效性和可靠性，认真完成本次作业。
医院检验微生物作业指导书
1.目的 规范微生物实验室内部质量控制，确保临床报告的质量。 2.适用范围 微生物实验室的所有检验项目。 3.职责 实验室检验人员均需熟知并遵守本程序。 4.程序 4.1分析前质量控制 4.1.1检验申请单：临床医生应按照《微生物检验项目申请程序》申请临床微生物检测口头申请追加样本检验项目，必须在样本有效期内申请.并补正式的检验申请单。 4.1.2生成微生物检验标本标签：护士应在核对医嘱患者信息和检验申请信息后，按照《微生物检验标本条形码程序》生成申请单和微生物检验项目标签，并将微生物检验项目标签正确张贴于标本容器上。 4.1.3样本采集手册：实验室应制订样本采集手册，指导正确采集和处理样本。 4.1.4样本采集和运输：样本采集人员应按照《采样前患者识别程序》确认患者，按照《标本采集、运送、保存程序》采集样本，并在规定的时间和温度范围内，使用指定的运输培养基，安全运送到微生物室。 4.1.5样本的接收：样本接收人员应严格按照《标本接收、标识及信息录人程序》《标本拒收程序》对样本接收或拒收，并记录。 4.1.6微生物检验标本信息输人：微生物实验室接种岗位检验人员严格按照相关的微生物标本检验信息输，人程序录人，核对患者信息和标本信息等资料。 4.1.7样本储存：微生物实验室接种岗位检验人员按照相关的微生物标本检验前储存程序正确铺存未能及时处理的标本，已经检验的样本应在保证其性质稳
定的条件下，将样本以适当的方式保留到规定时间内，以便能在出具结果报告后可以复查，成做补无检食。 4.2分析中质量控制 4.2.1试剂的质量控制 4.2.1.1所有试剂用于检测标本前，必须做质控以验证试剂性能并记录质控结果，只有质控合格才可使用（表2-1-1）。质控应遵循以下原则。 4.2.1.1.1使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周（若检测频率小于每周1次,则实验当日）用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测。 4.2.1.2平行试验：新批号试剂使用前须用老试利或参考材料平行试验。 4.2.1.3无厂商特别说明时，不同批号的试剂不可混用。 4.2.1.4缺陷或失效试剂只能用于培训员工业务能力，否则报废处理。培训试剂应明显标记“仅供培训使用"，并与检验试剂分开放置。 4.2.2培养基的质量控制 4.2.2.1培养基外观良好（平滑、水分适宜、无污染、适当的颜色和厚度，试管培养基湿度适宜），新批号及每一贷次的商品成自配培养基应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等，应以质控菌株进行验证。 4.2.2.2外观检查合格的培养基的标准：完整，琼脂附于平板底部，血平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色好、湿润，无干裂、无污染、无浑浊或沉淀、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，应不予使用。 4.2.2.3无菌试验时抽检培养基数量：100块以内，随机抽检5%;100块以上可随机取10块平板或10支试管培养基进行无南试验。35C培养24h后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。 4.2.2.4 生长试验及生化反应试验：质控菌栋（表2-1-2.表2-1-3）于35C培养24h，用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位的细菌胁悬液。无菌生理盐水1：100稀释，每块平板接种10μ（浓度相当于103~104CFU/平板），培养24~48h。符合生长、
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 2。蛋白酶产生菌的分离与纯化 2。1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化. 2。2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。 2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 2。4 实验方法与步骤 2。4.1 分离 1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液； 2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌； 3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h； 4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 2。4。2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。 2.5 实验结果 在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。 1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2)报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值)结果。
环境微生物实验指导书
试验一培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基和豆芽汁葡萄糖培养基分别用于霉菌和酵母菌的分离培养。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。 【仪器与用品】 天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白陈1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100ml pH 7.2~7.4 2．配制方法
（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于唐瓷缸中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述唐瓷缸中。将唐瓷缸加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化。 （2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/l NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至50℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 二、高氏一号培养基的配制 1．培养基成分 可溶性淀粉20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.2～7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：量取所需水量的2/3左右加入到搪瓷缸中，加热至沸腾。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后到如上述沸水的搪瓷缸中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。 （2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。 （3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/l NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。
水微生物学实验指导书
水微生物学实验指导书 武汉科技大学城市建设学院 给排水工程系 2007.12
目录页 实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察 实验二培养基的制备及灭菌 微生物的纯种分离及计数 实验三微生物生理生化特性
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察 一、实验目的 1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。 2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验内容 1．显微镜的使用方法和保养方法 2．微生物形态的观察 三、实验仪器、设备及材料 1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等 2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。 四、实验原理 显微镜的结构和各部分的作用 图1是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括： 1．镜筒镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有3个接物镜。 2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。 3．调节器镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。 光学部分主要包括： 1．接目镜一股使用的显微镜具有2—3种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5×”、“10×”或“16×”等数字及符号。意即使用时可放大5倍、10倍或16倍。观察微生物时常用放大10倍或16倍的接目镜。 2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40 (45)、100。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如：用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400。如果用放大100倍的接物镜则放大倍数为100×10＝1000。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的用低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。 油镜的放大倍数最大(100)。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短．直径就很小。所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜)不同、有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所
医学免疫学与微生物学 实验指导
《医学微生物学与医学免疫学》实验指导 前言 医学微生物学与免疫学是医学院校必设的基础课程之一，该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。本书结合中药学专业的教学工作实际，编实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。 实验学时：4学时 形态二《医学微生物学》实验指导 实验一细菌分布检测、理化及药物因素对细菌影响的检测 （一）细菌分布的检测 【实验目的与要求】 1.掌握无菌操作技术。 2.熟悉细菌菌落的观察及计数方法。 3.了解微生物在自然界及正常人体的分布，增强无菌观念。 【实验原理】 细菌广泛分布于自然界中，人的体表和与外界相通的腔道中也有细菌存在。通过本次实验理解微生物学科实验中强调无菌操作、防止污染和感染的重要性，为今后在医疗实践中建立牢固的无菌观念打下基础。 【实验仪器、器材与试剂】 1.实验仪器和器材：无菌平皿、普通琼脂平板、血平板、高层琼脂培养基、微波炉、无菌吸管、胶帽、酒精灯、打火机、无菌试管、试管架等。 2.实验试剂：自来水或纯净水、生理盐水等。 【实验项目、方法与步骤】 1.空气中细菌分布的检测——沉降法 （1）取一个普通琼脂平板并作好标记。 （2）置于实验室某处，揭开盖。操作时不要用手接触培养基，以免造成结果误差。 （3）让培养基暴露在空气中30min，然后盖好皿盖，置37℃生化培养箱内培养18～24h。（4）取出观察并纪录结果。
微生物学实验教程
Ⅰ、微生物学实验室常用的器皿 微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。 一、器皿的种类、要求与应用 1．试管（test tube） 微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图Ⅰ-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图Ⅰ-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图Ⅰ-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。 （1）大试管（约18×180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。 （2）中试管（约13—15×100—150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。高等医学院校实验教材 医学微生物与免疫学 实验指导 主编韩莉 副主编张昌菊宋利琼
编者 (以姓氏笔画为序) 王磊朱平刘嘉刘英 宋利琼吴红艳杨建林周永芹 张颖张昌菊韩莉 三峡大学医学院生物病原部 2005年6月29日 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 31 目录 第一篇医学微生物学 实验室规则 (2) 实验一常见细菌形态学检查方法(综合性实验) (3) 实验二细菌的分离培养法与消毒灭菌(综合性实验) (11) 实验三化脓性球菌的分离鉴定(设计性实验) (27) 实验四肠道杆菌的分离鉴定(设计性实验) (32) 实验五厌氧菌,分支杆菌的检查法(综合性实验) (41) 实验六各种微生物形态,病毒学检查法(综合性实验) (46) 微生物学各论自学提纲 (56) 第二篇医学免疫学 实验一天然免疫功能的检测(综合性实验) (60) 实验二常见抗原抗体反应(综合性实验) (67) 实验三细胞免疫检测I:细胞因子的检测(设计性实验) (86) 实验四细胞免疫检测Ⅱ:淋巴细胞分离,计数及活性检测(设计性实验) (94) 实验五细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖实验(设计性实验) (103) 综合复习 (107) 附录 (113) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设 计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。 一、实验目的 通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态 度，培养科研协作精神。 二、实验内容 实验一工业微生物菌种分离 根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。 1、分离培养基的配制 2、无菌器材的准备 3、菌悬液的制备 4、接种 5、培养 6、初步鉴定 (1) 菌落形态 (2) 个体形态 7、斜面接种培养 实验二工业微生物菌种复筛 通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。 1、发酵培养基的配制； 2、目的菌株的摇瓶培养； 3、发酵液的生理活性测定。 实验三微生物的诱变育种 用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。 1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备； 2、致死曲线的测定； 3、诱变处理；
4、初筛； 5、复筛； 6、菌种保藏。 三、实验要求 1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。 2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭 他人的数据。 四、考核办法 1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。 2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。 3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。