谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒说明书 微量法
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC1195规格:100T/48S 产品简介：
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px 或GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX 催化H 2O 2氧化GSH，产生GSSG，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。产品内容：
提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5.5mL 蒸馏水溶解；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3.3mL 蒸馏水溶解备用；
试剂三：液体10μL×1支，临用前按1μL 试剂三：499μL 蒸馏水的比例稀释试剂三，4℃保存。现用现配；
试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可；
试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL 蒸馏水溶解备用；
标准品：粉剂×1支，10mg 还原型谷胱甘肽，4℃保存。临用前加入1.62mL 蒸馏水溶解为20μmol/mL 的标准溶液备用。
操作步骤：
一、粗酶液的提取：
1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。
2、细菌、真菌：按照细胞数量104个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。
3、血清（浆）等液体：直接测定。
二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.3125μmol/mL的标准溶液。再吸取20μL各标准溶液与80μL
试剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.0625μmol/mL。标准液混合物现用现配。
3、将30μL样本与30μL试剂一混合后室温放置5min。
4、操作表：(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂)
测定管对照管样品混合物（μL）20-
试剂二（μL）2020
37℃下预热5min
试剂三（μL）2020
37℃下反应5min
试剂四（μL）200200
样品混合物（μL）-20
4000rpm常温离心5min，取上清于EP管或者96孔板中。
试剂名称(μL)测定管对照管标准管空白管上清液100100--标准液混合物--100-试剂四---100
试剂五40404040
试剂六40404040
蒸馏水20202020
混匀后室温放置2min，测定412nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算△A测定=A对照管-A测定管，△A标准=A标准管-A空白管。
GPX活性计算：
1、抑制百分率的计算
抑制百分率＝(A对照管-A测定管)÷（A对照管-A空白管）×100%
尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样品。
2、GPX活性计算
（1）按蛋白浓度计算
活力单位定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX(U/mg prot)=ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷（Cpr×V样）÷T
=325×ΔA测定÷△A标准÷Cpr。
（2）按样本鲜重计算
活力单位定义：每g样品在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX(U/g鲜重)=ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷(V样÷V样总×W)÷T
=325×ΔA测定÷△A标准÷W。
(3).按细胞数量计算
活力单位定义：每104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX(U/104cell)=ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T =325×ΔA测定÷△A标准÷细胞数量。
(4).按液体体积计算
活力单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX(U/mL)=ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷V样÷T=325×ΔA测定÷△A标准。
C标：标准液混合物的浓度：0.05μmol/mL；V酶促：酶促反应体系体积，0.26mL；
V样：样本混合物中含有的样本体积，0.01mL；V样总：提取液体积，1mL；
Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，5min；
细胞数量：以万计；W：样品质量，g；
1000：换算系数，1μmol=1000nmol。
注意事项
1、反应完成后建议在10min内检测完成。
2、吸光度若大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。
谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)试剂盒说明书
货号: MS1204 规格：100管/96样 谷胱甘肽S-转移酶 （glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为 GST 具有 GSH-Px 活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加GSSG 含量。 测定原理： GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm 波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加2 mL蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂三放在 25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL试剂一，180μL试剂二和20μL试剂三， 迅速混匀后于340nm 测定吸光度变化，记录10s和310s吸光度为 A1 和 A2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL试剂二和20μL试剂三， 迅速混匀后于340nm 测定吸光度变化，记录10s和310s吸光度为A3和 A4。 注意：空白管只需测定一次。 第1页，共3页
谷胱甘肽含量测定
【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计 2.实验试剂 还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。 3.实验材料 小麦叶片 【实验步骤】 1.标准曲线制作 取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 试管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10 2.提取 取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。 3.测定 取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。 显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。 4.计算 GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S） 式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。 【实验结果】 1.标准曲线 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10 吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723 以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。
谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一
谷胱甘肽转移酶（GST） 还原型谷胱甘肽占绝大多数。 谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。 GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。 通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。 研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。 与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。 近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。 抗肿瘤药物与GSH作用模式图：
图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起， 其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤； ③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。 机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。 筛选方法： 方法一：比色法 在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。 实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。 实验材料： 试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。 仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。
谷胱甘肽还原酶检测试剂盒简介
谷胱甘肽还原酶检测试剂简介 谷胱甘肽还原酶的作用： 一、谷胱甘肽还原酶（GR）在人类细胞中具有极其重要的生理功能，广泛存在于人体肝、肾、心红细胞、单核巨噬细胞等组织细胞中。它可及时地清除人体代谢过程中产生的氧自由基（OFR），是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的主要黄素酶。对保护肝细胞膜完整具有非常重要的作用意义。 在《临床肝病实验诊断学》和《临床检验诊断解析》中明确标示，血清谷胱甘肽还原酶活性测定可用于协助诊断肝脏疾病，血清谷胱甘肽还原酶活性上升可以辅助诊断肝炎、肝硬化、梗阻性黄疸及相当数量引发的肝肿瘤。原发性肝细胞癌和广泛转移性肝肿瘤时，血清谷胱甘肽还原酶活性明显升高，急性病毒性肝炎或中毒性肝炎中度升高，而肝硬化是血清GR轻度升高。 二：检测谷胱甘肽还原酶的临床意义 1、急性肝炎早期阶段，血清谷胱甘肽还原酶敏感性最高，可用于肝损的早期检测； 2、急性肝炎患者GR比转氨酶更早增加达到峰值，早早期肝脏损伤判断的首选指标； 3、GR有助于判断亚临床DILI，提高临床DILI的诊断率 4、不同于ALT和AST在肝细胞膜破裂和线粒体破裂时才能检测出来，GR填补肝细胞受损早期自我修复阶段至破裂进程中诊断的空白，将更有利于早期肝炎的诊断和治疗
三、临床解读： 谷胱甘肽和谷丙、谷草在化验单上的具体解读，谷胱甘肽的血清血浆正常值是33-73U/L，共有四种情况。 1、谷胱甘肽指标升高，谷丙和谷草指标正常，提示有肝损伤的风险，建议加强对肝脏的检测频率，有利于发现早期肝损伤。 2、谷胱与谷丙，谷草同时升高，提示进入肝损伤爆发期，建议临床治疗措施干预。 3、谷胱甘肽升高，谷丙、谷草下降，提示正在进行肝损伤修复，可以结合三者评估临床治疗情况。 4、当三者都出现下降，情况有两种极端提示：（1）是修复完成，临床好转。（2）是重型肝炎出现严重情况，出现胆酶分离现象。 另外一种是红细胞的检测，正常值4.7-13.2U/gHb 红细胞主要针对“蚕豆病”和遗传性伯氨喹溶血病人，谷胱甘肽还原酶降低，红细胞的细胞膜容易被氧化和分解，导致溶血性贫血和溶血性黄疸。
谷胱甘肽过氧化物酶
本科生毕业论文（设计）
题 姓 学 专 班 学
目: 名: 院: 业: 级: 号:
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中 的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响 于南 生命科学学院 生物科学 生物科学 101 班 13210101 师亮 职称: 讲师
指导教师:
2013 年 5 月 20 日 南京农业大学教务处制
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目录
摘要 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 关键词 ...................................................................................................... 错误！未定义书签。 Abstract ................................................................................................... 错误！未定义书签。 Key words ................................................................................................ 错误！未定义书签。 引言 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 1 材料与方法 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 1．1 材料 ....................................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．1 菌种 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．2 CYM 培养基 ............................................................ 错误！未定义书签。 1．1．3 PDA 固体培养基 ..................................................... 错误！未定义书签。 1．1．4 试剂 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．5 主要仪器设备 .......................................................... 错误！未定义书签。 1．2 实验方法 ............................................................................... 错误！未定义书签。 1．2．1 ROS 的测定 ............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．2 NBT 测定 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．3 DAB 染色 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．4 菌株对氧化物耐受性的检测 .................................. 错误！未定义书签。 1．2．5 胞内 Ca2+的荧光检测 .............................................. 错误！未定义书签。 1．2．6 三萜的测定 .............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．7 菌丝分叉检测 .......................................................... 错误！未定义书签。 2 结果与分析 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 2．1 GPX 沉默转化子胞内 ROS 含量上升 ......................... 错误！未定义书签。 2．2 NBT 染色显示 GPX 沉默转化子胞内超氧根离子含量上升错误！未定义书签。 2．3 DAB 染色显示 GPX 沉默转化子胞内 H2O2 含量下降...... 错误！未定义书签。 2．4 GPX 沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降 ...... 错误！未定义书签。 2．5 GPX 沉默转化子胞内 Ca2+的含量下降 .............................. 错误！未定义书签。 2．6 GPX 沉默转化子菌株的三萜含量下降： .......................... 错误！未定义书签。 2．7 GPX 沉默转化子菌丝的分叉数减少 .................................. 错误！未定义书签。 3 讨论 .................................................................................................... 错误！未定义书签。 致谢 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 参考文献 .................................................................................................. 错误！未定义书签。
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谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase ,GST)活性测定试剂盒使用说明
谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）活性测定试剂盒使用说明货号：SN101 规格：50管/48样 产品简介： 谷胱甘肽S-转硫酶（GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与谷胱甘肽巯基的共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-SeGSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm，通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml石英比色皿、双蒸水 产品内容： 试剂一：试剂一×1支，用前充分溶解于100ml双蒸水中，4℃保存3个月 试剂二：粉剂二×1支；稀释液二×1管，用前将稀释液二加入粉剂二中充分溶解后加双蒸水至 5.0ml，4℃保存3个月 试剂三：粉剂三×1支，4℃保存3个月，临用前加试剂一 5.0ml充分溶解，临用前配制。
操作步骤： 一、样品测定的准备： 称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清(如上清不清澈，再离心3min)。 二、GST测定操作 1、混合试剂配制：将试剂二与试剂一按1：8混合 2、试剂三放在25℃预温 3、分光光度计调到340nm处，设定时间为5min，用双蒸水调零 4、取0.1ml样品与0.9ml混合液混合，于25℃预温5min，再加入试剂三0.1ml，迅速混匀，于340nm处测定5min内吸光值的变化,第0s的吸光值记为A1，第300s的吸光值记为A2 5、空白管测定为操作4中以0.1ml试剂一代替0.1ml样品液 酶活计算： 一、血液GST活性计算 1、GST活力单位定义：在25℃下，每ml血液每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为U。 2、计算公式： GST（U/ml）=ΔA340/min×〔106/(ε·d)〕×（V总/V样）=ΔA/min×106/(9.6×103×1)〕×1.1/0.1=ΔA340/min×1145.83
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活性测定试剂盒说明书
货号：QS1111 规格：50管/48样 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。 测定原理： GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0 mL蒸馏水，混匀。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 操作步骤： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入850μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，充分混匀，于340nm 处测定10 s和190 s吸光度，记为A空1和A空2，△A空白管= A空1﹣A空2。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入750μL试剂一，100μL试剂二，100μL上清液，50μL 试剂三，充分混匀，于340nm测定10 s和190 s吸光度，记为A测1和A测2，△A测定管= A 测1﹣A测2。 注意：空白管只需要测定一次。 计算公式： 第1页，共2页
谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC1190规格:50T/24S 产品简介： 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px/GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。 GPX 催化H 2O 2氧化GSH，产生GSSG，GSH 能与DTNB 生成在412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应GPX 的活性。试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、天平、台式离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管。产品内容： 提取液：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5.5mL 蒸馏水溶解；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6.6mL 蒸馏水溶解备用； 试剂三：液体20μL×1支，临用前按1μL 试剂三：499μL 蒸馏水的比例稀释试剂三，4℃保存。现用现配； 试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存；瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可； 试剂五：液体15mL×1瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入15mL 蒸馏水溶解备用； 标准品：粉剂×1支，10mg 还原型谷胱甘肽，4℃保存。临用前加入1.62mL 蒸馏水溶解为20μmol/mL 的标准溶液备用。操作步骤：
一、粗酶液的提取： 1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 2、细菌、真菌：按照细胞数量104个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。 3、血清（浆）等液体：直接测定。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。 2、将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.25μmol/mL的标准溶液。再吸取100μL标准溶液与400μL试 剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.05μmol/mL。标准液混合物现用现配。 3、将150μL样本与150μL试剂一混合后室温放置5min。 4、操作表：(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) 测定管对照管样品混合物（μL）100- 试剂二（μL）100100 37℃下预热5min 试剂三（μL）100100 37℃下反应5min 试剂四（mL）11 样品混合物（μL）-100 4000rpm常温离心5min，取上清。 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管上清液500500--标准液混合物--500-试剂四---500 试剂五200200200200 试剂六200200200200 蒸馏水100100100100
谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0350 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加5mL蒸馏水溶解。 产品说明： 谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 第1页，共3页
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 二、测定： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3.空白管：取1mL石英比色皿，加入100μL试剂一，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A1，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A2。 4.测定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A3，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A4。 三、GST活性计算： （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。 GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷（ε×d）×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。 GST（U/g鲜重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活单位。 第2页，共3页
谷胱甘肽含量测定
植物生理学模块实验指导 玲主编 科学 还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na 2 -EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶 解稀释至100ml。再称取186mg Na 2-EDTA·2H 2 O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。 0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。 0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。
谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书 微量法
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0355 规格：100T/96S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2mL蒸馏水溶解。 产品说明： GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 二、测定： 1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2.试剂二放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3.空白管：取微量石英比色皿，加入20μL试剂一，180μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A1，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A2。 4.测定管：取微量石英比色皿，加入20μL上清液，180μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A3，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A4。 三、GST活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。GST（U/g鲜重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活单位。GST（U/104cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷500
谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展
动物医学进展,2008,29(10):53-56 Pr ogress in Veterinary Medicine 文献综述 谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展* 马森 (武夷学院化学系福建省高校绿色化工技术重点实验室,福建武夷354300) 摘要:谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转硫酶(GST)是一对抗氧化酶。GSH-Px为含硒半胱氨酸,至少有4种同工酶,催化还原H2O2和有机氢过氧化物。GST不含硒,有多种同工酶,不能分解H2O2,但具有清除过氧化物和解毒的双重功能。二者广泛存在于组织细胞、红细胞、血浆和乳中,与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老、多种疾病的发生有关;GSH-Px活性也与机体硒水平密切相关。文章综述了GSH-Px 和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展。 关键词:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽转硫酶;研究进展 中图分类号:Q554.6文献标识码:A文章编号:1007-5038(2008)10-0053-04 谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathione pero xidase, GSH-Px)于1957年由M ills从牛红细胞中发现,分子结构中含硒,故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px),是体内清除H2O2和许多有机氢过氧化物的重要酶。1976年,Law rence等发现组织中还存在一种不含硒的GSH-Px,命名为谷胱甘肽转硫酶或不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathio ne-S-tr ansferase,GST或on-Se-GSH-Px),在体内具有清除过氧化物及解毒的双重功能。文章对GSH-Px和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展进行了阐述。 1分类与结构 从人和动物组织或细胞中提纯的GSH-Px,分子质量为76ku~95ku,为水溶性四聚体蛋白,4个亚基相同或极为类似,每个亚基有1个硒原子。目前发现GSH-Px至少有4种同工酶,其在机体中的分布、亚基结构、一级序列和酶学特点上有显著不同。第1种为细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPx),主要分布在组织细胞的细胞区、线粒体和红细胞中,催化还原H2O2和有机氢过氧化物,对各类氢过氧化物都有较好的催化作用。第2种为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PH GPX),主要分布在各种组织细胞外的细胞液内,部分分布在细胞膜上,主要还原磷脂过氧化氢、脂肪酸过氧化氢和甾体过氧化氢, PH GPX是必需的生物膜组成成分,可阻止生物膜非专一性的磷脂过氧化。第3种为血浆谷胱甘肽过氧化物酶(pGPx),主要分布在血液中,既能还原磷脂氢过氧化物又能还原H2O2。第4种为消化系统谷胱甘肽过氧化物酶(GIGPX),高表达于胃肠道黏膜上皮细胞。牛红细胞GSH-Px有178个氨基酸,第35位是1个硒半胱氨酸。在其亚基结构中有4处A-螺旋和4处B-折叠。整个酶分子中,4个亚基处在一个平面,具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子表面凹穴的活性部位,易于接触有机氢过氧化物等底物。后者虽然不溶于水,但由于活性基团周围存在一些疏水性芳香环氨基酸残基,形成脂溶性底物可进入的疏水区域,可以与硒半胱氨酸反应,从而使GSH-Px显示很高的反应性。GST是分子质量40ku~50ku的二聚体蛋白质,随着亚基的不同组合而有多种同工酶,如哺乳动物的GST分为A, L,P,H,R等5类水溶性GST,另外还有一类是脂溶性的微粒体同工酶。随着对GST的深入研究,新GST种类不断被发现。已确定了上述5种主要的酶家族中至少一个成员的三维结构,这些结构都具有包括两个结构域的基本蛋白质折叠。大鼠肝胞浆GST是由Ya、Yb、Yc3种不同亚基组合成的YaYa、YcYc、YaYc、YbYb等同工酶,亚基的分子质量为22.5ku~25ku;大鼠肝微粒体GST的亚基分子质量却为14ku;不同来源的GST中氨基酸组成可能有差异,分子质量常不一致[1-5]。 *收稿日期:2008-05-04 基金项目:福建省教育厅/乳谷胱甘肽过氧化物酶研究0项目(JB03266) 作者简介:马森(1947-),男,青海西宁人,教授,主要从事动物生理生化研究。
谷胱甘肽
谷胱甘肽（glutathione） 谷胱甘肽(glfftathione)是由Hopkins发现并命名，1929年Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱甘肽化学名为：N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，即N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione，GSSG)。通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，是由r一谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。 1 GSH的理化特性 谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)，晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5.93，成品见光易分解，易氧化，谷胱甘肽分子中有一特殊的6-肽键，即由谷氨酸的6-COOH与半胱氨酸的a-NH：缩合而成，这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中Q-COOH和另一个氨基酸中α-NH2失水缩合而成的肽键显然不同。由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化，2分子还原型谷胱甘肽(简称GSH)，脱氢以二硫键-S-S-)相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG)，所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类，在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。 2 GSH在自然界中的分布 谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽。在动物细胞中还原型谷胱甘肽水平达5mmol／L，而氧化型仅为0．1mmol／L，细胞内高水平的GSH对动物机体维持正常机能是十分重要的。据测定，谷胱甘肽在未加工的肉中含量是50～200mg／kg，在新鲜水果和蔬菜中的含量是50～150mg／kg，干燥酵母中含有约．15％的谷胱甘肽，在乳制品、谷物和熟食品中含量较低。 3 GSH的代谢过程 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环的GSH可被一些组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞膜上的r-谷氨酰转肽酶(rGT)降解为r-谷氨酰氨基酸(氨基酸来自细胞外液中的游离氨基酸)和半胱氨酰甘氨酸，而后被二肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r-GT和二肽酶活性，它们是清除循环系统中GSH的主要器官。在细胞内，GSH的组成氨基酸在r-谷氨酰环化转移酶、r-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱甘肽。GSH的合成通过其自身对r-谷氨酰半胱氨酸合成酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成GSH的主要场所。细胞内的谷胱甘肽在谷胱甘肽硫转移酶(GST)的催化下，可与细胞内外产生的活性亲电子基、有机氢过氧化物(x)结合成GSH-S-复合物，经一系列反应生成N-乙酰-Cys-(x)后运出细胞而排出体外。GSH清除细胞内自由基、过氧化物、ROOH的同时，2分子的GSH转变为GSSG，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GR)作用下由NADPH供氢还原为GSH。上述反应形成r-谷氨酰循环。由于猪肾脏中的r-GT与肝脏中的r_GT活力比较低，因此对于猪，肝脏和胆管分支在GSH周转中起重要作用。 4 GSH的生物学功能 谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉毒素等毒物；(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；(3)利于铁的吸收、硒的吸收、钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收时或吸收后恢复为正常的脂肪；(4)保护胃肠道黏膜上皮，防止因炎症、局部缺血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；(5)贮存并提供其组成氨基酸(1尤其是半胱氧酸)；(6)参与蛋白质和DNA的合成;(7)作为还原物质，利于维生素E、维生素c的还原，维持巯基酶活性，并可作为甘油醛磷酸脱