葡萄糖异构酶

葡萄糖异构酶研究概况

摘要：葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GI)能催化D—葡萄糖至D—果糖的异构化反应，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶，目前国内外众多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用。葡萄糖异构酶的研究主要包括菌种的筛选、发酵条件的优化以及酶的固定化生产等方面。

关键字：葡萄糖异构酶菌种分离纯化固定化

一、葡萄糖异构酶简介

葡萄糖异构酶(Gl)又称D-木糖异构酶（D-xylose isomerase），为一种水溶性酶。1957年在嗜水假单胞菌中最早发现了GI，它能催化D一葡萄糖至D一果糖的异构化反应，特别是在果葡糖浆的生产中，是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆(high fructose cord syrup，HFCS)的关键酶，并且该酶还能够将木聚糖异构化为木酮糖，再经微生物发酵后生产乙醇。应用这种酶可以使葡萄长期以来糖浆中90%以上的糖分转化为果精，使甜度大大提高，因而可用淀粉作原料生产出食用性良好的葡果糖浆。为了解决食糖供应不足，六十年代末期以来，葡萄糖异构酶的生产与应用的研究引起了人们的重视。

二、产葡萄糖异构酶的微生物

产葡萄糖异构酶的菌株很多，主要有沙门氏菌、大肠杆菌、枯草杆菌属、葡萄球菌属、链霉菌属及其他菌属。大多数是从土壤中分离出来的。放线菌具有葡萄糖异构酶产量多，酶的热稳定性好等优点，并且在酶反应时不需要添加砷酸盐或锰盐等有毒物质。分离异构酶产生菌，一般采用木糖作唯一碳源，如吉村贞彦等使用D—木糖1%、酵母膏0.1 %、磷酸氮二钾0.05 %、硫酸镁0.025 %、硫酸锰0.001 %和碳酸钙0.2 %组成培养基，在含有10毫升上述培养基的试管中，接入土样。45℃培养24小时，连续富集培养三次，然后于加入2 %琼脂的上述培养中，进行平板分离，移入斜面，再进行摇瓶发酵，测定葡萄糖异构酶活力。

除土壤分离新菌种外，另外对原有菌种进行强烈因子处理。如Bengtson用亚硝基胍或紫外线诱变Streptomyces ATCC 21175能显著提高酶活，经处理的菌种酶活力为518单位/毫升，而不处理的仅有3 18单位/毫升。

三、葡萄糖异构酶发酵条件

3.1 碳源对形成葡萄糖异构酶的影响

葡萄糖异构酶是一种诱导酶，一般需要在培养基中加入木糖一类物质，才能促进酶的形成。但木糖价格昂贵，不易实现工业化生产。高崎义幸研究可用麸皮代替木糖进行培养，又用棉籽壳与玉米芯的酸水解物代替木糖也收到好的效果。

Park等认为酸水解玉米芯或麸皮作为诱导剂，能促进酶的形成，而用碱水解却不产酶。高崎义幸指出麸皮浸出液( 100℃，2小时)，在pH5.0，80℃，用ɑ-淀粉酶处理后能增加S. albu YT4酶活及缩短发酵时间。又认为木二糖比木糖作为诱导物更有效，当培养基有木二糖或木聚糖和木糖共存时，酶活力更显著增加。高崎义幸在培养链霉菌时，添加0.2 %木二糖到含有0.5 %木聚糖的培养基中，PH7.0 ，30℃，培养33小时，与不加木二糖相比，酶活力能成倍增长。有些研究者报道在培养基中加人葡萄糖、山梨醇能维持一定pH，同时山梨醇能增加产酶量。

3.2氮源对生产葡萄糖异构酶的影响

高崎义幸认为玉米浆、酪素酸解液及酶解液对链霉菌产生葡萄糖异构酶较合适。多数都采用玉米浆作为氮源，也有使用硝酸铵、磷酸铵等作为氮源。Heady 为促进酶产量，培养S.olivochromogenes ATCC 21114时，在培养基中加入甘氨酸及硝酸铵，能显著刺激酶活，增加酶量两倍多。

四、葡萄糖异构酶的分离纯化

4.1葡萄糖异构酶的提取

酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。

葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接用其菌体，进行反应。提取胞内酶，首先要做的工作就是破碎细胞（细胞壁、细胞膜），然后将含有酶活性的部分用过滤或离心的方法去除残留细胞以及细胞碎片，从而进一步得到澄清的溶液。再采用逐步逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化。常用破碎处理法：

1、机械破碎法：指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来；

2、物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来；

3、化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变；

4、酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来。

4.2纯酶的分离纯化

4.2.1DEAE-----纤维素离子交换层析

离子交换柱层析粗酶液经过DEAE—纤维素DE—52柱(3x11cm)层析分离，当上样量使柱饱和后，用含有不同浓度NaCl的0.02摩尔/磷酸钠缓冲液梯度洗脱并收集活力峰，SePhadexG—200柱层析，将离子交换所得活性组分适当浓缩，加至平衡后的SephadexG—200柱(2X10oem)上，Zsonm监测下收集活力峰，圆盘电泳检测为均一带。

4.2.2 SePhadex凝胶过滤

在离子交换柱层析分离的基础上，将所收集的活性组分透析浓缩后，分别在SephadexG—150和SephadexG—200两种介质上进行了分离实验，选用最适柱长及柱内径。

以产酶菌株：玫瑰红336变异株分离纯化为例进行以下阐述：

酶的分离纯化过程：

(l) 酶的抽提：将所制得的丙酮干粉按50 m L/ g 干粉之比加入0.05 mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，磁力搅拌3 h后离心15min(400 r/min)得上清为粗酶液。若要提高产率，可以进行多次抽提。

(2)DEAE—52 纤维素柱层析：粗酶液直接上DEAE—52 纤维素柱，依次用0.05mol/L磷酸缓冲液配制的0.1，0.15，0.2，0.3 mol/L NaCl溶液(pH7.5 )洗脱，收集0.2 mol/LNaCl溶液的洗脱峰，必要时可再收集0.3 mol/L NaCl洗脱下来的活力峰( 见图1 )。

(3) 硫酸铵分级：将收集的酶液用固体硫酸铁调至饱和度为0.3，在5℃搅拌1h，离心(10000 r/min)得上清后再用硫酸铁调至饱和度为0.45，5℃下搅拌l h 后，离心得有酶活力的沉淀。加0.05 mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解后，透析过夜。

与一般做法不同，硫酸铁分级安排在DEAE—52纤维素处理后，避免了硫酸铵用量大、杂蛋白浓度低使硫酸铵分级不易处理的弊端。抽提液经DEAE—纤维素层析后样品体积小、杂蛋白浓度低，可以选择较窄的硫酸铵饱和度区间。

(4) DEAE—Sephadex A—50柱层析：上步所得酶液上DEAE—Sephadex A—50柱，用0.05 mol/L 磷酸缓冲液(PH 7.8)配制的0.1~ 0 .5 mol/L NaCl溶液进行连续梯度洗脱,收集0.35 ~0.48 mol/L浓度范围的洗脱液(见图2 )

(5) SePhadex G—20柱层析：将上步收集的酶液经聚乙二醇反透析浓缩后，取3~5mL上Sephadex G—200柱，用0.05mol/L，pH7.5整磷酸缓冲液洗脱，收集活力峰(见图3)。

(6)丙酮干粉法与超声波法比较：与前人提纯GI不同的是我们在细胞破碎时采用丙酮干粉法取代了常规的超声波和自溶法。在活力收率相近的基础上，比活有较大的提高，说明杂蛋白量减少。同时OD280/OD260大于1.0，说明核酸污染较小（见表1）

以上各层析过程均在5℃下进行，各步提纯的数据见表2。采用7%聚丙烯酞胺凝胶对纯化酶进行电泳分析，结果证实是均一的( 见图4)，此图也显示了各提纯阶段样品电泳后的情形。

五、葡萄糖异构酶的固定化

葡萄糖异构酶固定化技术在工业和生物技术的应用中有多种优势，包括可以反复使用，反应产物易于从生物催化剂中分离，酶稳定性的改善，在填充床反应器的连续操作和酶物质的选择。近年来固定化葡萄糖异构酶越来越多地被用于工业化生产果葡糖浆中，主要因为他们对pH值、极端温度和有机溶剂具有较好的耐受性。工业上使用固定化异构酶进行异构化反应时具有许多优点：由于固定化异构酶不溶于水，产物的提纯分离大为简化，用于食品加工，不影响产品风味；酶在固定化后，稳定性增加，可长期使用和连续反应，从而提高产品质量，工厂的规模减小，自动化程度增加。因为葡萄糖异构酶没有一种特定的固定化方法，所以固定化必须要谨慎对待。

5.1固定化葡萄糖异构酶的影响因素

在固定化生产中，PH、温度、氧气浓度、金属离子、底物纯度以及副产物等因素都会影响酶的活性，从而影响酶的固定化的效果。现列举几个因素及其他们的作用如下：

5.2固定化葡萄糖异构酶载体材料

目前固定化葡萄糖异构酶的载体材料种类繁多，按其组成可以分为高分子载体、无机载体和磁性高分子微球等。高分子载体又分为天然高分子载体和合成高分子载体。

5.2.1天然高分子载体

天然多糖类化合物由于无毒，传质性能好和丰富易得等特点较适合担当酶的固定化载体材料，主要有壳聚糖、淀粉和海藻酸钠等。

(1)壳聚糖及其衍生物

壳聚糖(Chitosan)是一种由甲壳素经化学改性得到的天然高分子材料，多以戊二醛为交联剂的形式担当酶的固定化载体。宋箭等采用壳聚糖絮凝明胶包埋戊二醛交联固定化葡萄糖异构酶细胞。采用该法，菌丝体回收方便，产品质量稳定，收率高，固定化酶活力约8000单位/克绝干。产品机械强度好，转化能力稳定。

(2)海藻酸盐

海藻酸是一种天然的阴离子型聚电解质多糖，主要来源于海洋植物，无毒，具有良好的生物降解性和相容性。海藻酸(Alginate)不仅可与一价的Na+或K+结合为海藻酸钠或海藻酸钾，还可以与许多二价和三价阳离子结合如：海藻酸钙和海藻酸胺等，是较为理想的载体。但在含多价阴离子溶液及高浓度电解质溶液中海藻酸钙凝胶不稳定、Ca+离子易脱落，使其应用受到限制。为了克服以上缺点，Hayrettin.T.等研究了游离酶和固定化酶的各种特性，发现固化酶可以在很长一段时间内保持活性而且稳定性能也得到了较大的提高。

(3)淀粉接枝聚合物

淀粉广泛存在于各种植物成熟的果实中，具有可生物降解、无毒性等特点。用其作为酶的固定化载体不仅固定化方法简单，且对酶有一定的保护作用，易接枝，并对酶热处理一段时间后，酶的活力最大可提高40%，这为工业应用提供了一条新途径。葛玉斌等以多孔球状淀粉接枝共聚物为载体，以对p一硫酸酷己飒基苯胺(SESA)为载体活化剂，采用重氮化法共价偶联共固定糖化酶和葡萄糖异构酶，该共固定双酶体系适用于各种类型的淀粉底物，其催化效率是天然酶体系的1.6倍。

(4)丝素膜

家蚕丝纤维可作为固定化载体是由于其特殊的氨基酸组合和结晶结构。丝素膜做固定化载体具有独特的优点：使酶的pH稳定性、热稳定性大大提高；酶的最适pH值和最适温度发生偏移；有利于改变pH值和温度有效控制酶促反应和分解反应、提高反应速度；同时丝素蛋白膜制备简便、来源广、价格便宜、固定化方法简单。朱祥瑞等将脱胶蚕丝用稀碱溶液处理后制成多孔的碱化丝素，分别经物理吸附和戊二醛交联方法制得固定化酶，经对固定化酶性质的研究表明，碱化丝素和丝素粉末均能较好地固定葡萄糖异构酶。

5.2.2有机高分子合成载体

与低分子有机化合物相比，高分子合成载体具有很多宝贵性能，如机械强度大、可塑性强、耐热耐磨、耐溶剂、耐腐蚀、弹性高，使高分子材料具有非常广泛的应用。

刘建忠等用大孔径聚丙烯睛树脂固定化葡萄糖异构酶。聚丙烯睛树脂（PAN)的孔径是葡萄糖异构酶分子的2倍，且具有高比表面积，因此非常有利于Gl分子的吸附固定化。固定化葡萄糖异构酶(IGI)最适反应温度比天然酶提高15℃。

5.2.3无机载体

与有机材料相比，无机载体有，具有较高的机械强度、较好的稳定性、无毒、微生物不易分解、耐酸碱等优点。常见的无机载体材料有氧化铝、硅胶、玻璃等。

多孔玻璃或无机硅藻土由于不容易被微生物降解，具有较高的热稳定性和成本较低等优点，被固定化研究所重视。

（1）硅载体及多孔二氧化硅

目前在这一方面，经表面处理过的硅载体应用前景很好。已研究出的硅载体在固定化酶的方法有五种：通过金属键结合；用环氧交联剂结合；多聚赖氨酸吸附法；用含氨基的硅烷试剂结合；凝胶薄层包埋法。

Perminova L.v等，在单糖(葡萄糖和果糖)的异构化实验中，采用包埋法以二氧化硅凝胶为载体固定化，对异构化过程中葡萄糖异构酶活性和稳定性进行了研究，同时对不同的无机载体固定化制成的生物催化剂进行了比较，实验表明，得到的葡萄糖异构酶的最大活性为10U/g。

（2）氧化铝载体

陈永生等以低堆比的大孔氧化铝为核心，经化学修饰制成固定化葡萄糖异构酶。该氧化铝载体具有大孔容、低堆比，优良的孔结构和表面性质。有机膜经过化学修饰在氧化铝表面牢固结合，且官能团与酶结合能力较强。

（3）陶瓷载体

Kovalenko G.A等对单糖在未受损及未成长的烟草节杆菌细胞(产葡萄糖异

构酶)的悬浮液中异构化的动力学进行了研究，液面下培养的烟草节杆菌通过吸附含碳的泡沫陶瓷获得生物催化剂，葡萄糖异构酶的活性在70℃、14h的使用中相当稳定并保留原有活性，得到的固定化细胞的最大活性为2U/g。

六、葡萄糖异构酶的固定化方法

目前已报道的对于葡萄糖异构酶的固定化方法已发表近百种，但在工业中应用的只有七八种，包括包埋、吸附及细胞凝聚等。固定化在很多情况下都能够完成，但总会在某种程度上影响酶活性。归纳起来大致可以分为四种：包埋法、交联法、结合法和物理吸附法。

6.1包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞。酶经过包埋法固定化后，比较耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍(如5一磷酸二酯酶的工业应用)甚至几百倍(如青霉素酸化酶的工业应用)。另外，采用包埋法固定化酶的动力学行为会受到扩散阻力会而发生改变，使酶的活性降低。

包埋法会导致严重的扩散限制，这样就减弱了酶的表观活性，但是仍然有很多酶被包埋于载体网格中，显示出了包埋法同其他酶固定化方法一样甚至更好的保持的酶活，因为与共价法相比，包埋法往往非常温和，因此这种方法对于用共价法固定化容易失活的酶来说非常有用的。

6.2交联法

交联法是采用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或者多功能之间形成共价键，得到三维交联网状结构。常用的双功能试剂有戊二醛，乙二胺、顺丁烯二酸醉、双偶氮苯。其中应用最广泛的是戊二醛。

6.3结合法

结合法是通过物理或者化学过程，使之通过共价键或离子键与酶结合的固定化方法。用该法制备固定化酶时，须按照酶的种类及性质选择合适的载体和固载方法，因为所选的载体种类和固载方法对酶的担载量和反应性能有很大的影响。一般而言，载体的亲水性基团越多，表面积越大，固载的酶量越多，所得到的固定化酶的活性就越高。因为酶分子是生物大分子，通常首选葡聚糖、纤维素、多糖类衍生物和聚丙烯酞胺凝胶等有机高分子载体，可根据酶的性质和固定化方法选择合适的无机载体如5102、A1203、2102、TioZ和分子筛等，因为他们相对比较便宜，使用过程中不容易溶胀，流体力学性质好，机械强度较高。根据结合形式不同，结合法可分为共价结合法和离子结合法。

6.4物理吸附法

物理吸附法是将酶蛋白通过范德华力等弱相互作用吸附在不溶于水的载体表面上对酶进行固定化的方法。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶及轻基磷灰石等。

刘建忠等用大孔径聚丙烯睛树脂通过物理吸附法固定化葡萄糖异构酶，由于其高的比表面积，使得葡萄糖异构酶很好地吸附于载体上。

用物理吸附法固定化酶的过程中，酶蛋白的活性中心不易受到破坏，酶的高级结构变化也不明显，从载体对酶的适应性来讲，此方法较好，但缺点是酶与载体的相互作用很弱，被吸附的酶分子极易从载体表面脱落下来，所以在使用过程中受到一定的限制。

综上所述，酶的各种固定化方法都有其各自的优缺点，但其反应过程大同小异，如下所示为固定化葡萄糖异构酶反应器的见图：

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