江南大学微生物研究生复试内容

2005微生物实验操作复试

1有哪些方法可以提高显微镜的分辨率？

答：显微镜的分辨率（Resolving power ）是指显微镜将样品上相互接近的两点清晰分辨出来的能力。其用镜头所能分辨出的两点间的最小距离表示，距离越小，分辨能力越好。可用公式表示：

A

N D .21λ= 物镜的数值口径（Numberical aperture ），简写为（N.A ）：表示从聚光镜发出的锥形光柱照射在观察标本上，能被物镜所聚集的量。可用公式表示：

θsin .n A N =

n ——标本和物镜之间介质的折射率

θ——由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角

可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则D 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小D 值，可采取以下措施:

（1） 降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角θ值以提高NA 值。（4） 增加明暗反差。

2革兰氏染色的步骤？哪几步最为关键？

答：（1）1、细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养16-24h 。

2、制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min 后，用水洗去剩余染料。

4、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min ，水洗。

5、脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显紫色时，立即水洗。

6、复染：滴加番红液，染色2min ，水洗

7、用滤纸吸干，油镜镜检。

（2）脱色是革兰氏染色中最为关键的步骤，其中乙醇的浓度，用量及涂片厚度都会影响脱色速度，最终影响观察效果。如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性

3涂片染色前为什么要先进行固定？固定时应注意什么问题？

答：1）杀死微生物，固定细胞结构。

2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

注意问题：温度以载玻片接触手背，手背不觉得烫为宜，防止出现变形细胞；注意在通过火焰时，涂有细菌的一面向上。

4同一酵母菌培养液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？进一步比较两种计数法的优缺点？

答：所得结果不一样。血球计数板记得的菌体数是活菌体和死菌体的总和，而平板菌落计数法记得的是活菌体的量。

血球计数板优点是直观、快速，方便，但该法计数的是样品中的总菌落数，无法计数活菌数。平板菌落计数法的优点是能粗出样品中的活菌数，缺点是手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

5如何测定水中的大肠菌群数？测定水中大肠菌群数有什么实际意义？

答：大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析方法，包括处发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。具体方法为①采样、②处发酵试验③在指示性培养基上分离培养，④革兰氏染色及镜检，⑤复发酵试验，⑥结果。

检测意义：水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便，由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在非常困难。由于大肠杆菌在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，而且检测方法比较简便，因此采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠菌群菌数超过一定数

量，则说明此水已被粪便污染，肯能还有病原菌。

6高压蒸汽灭菌的基本原理以及步骤

答：高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定压力下保持15-30分钟进行灭菌。将待灭菌的物品放在一个密闭的加压锅内，通过加热，是灭菌锅内夹套间的水沸腾而产生蒸汽，待水蒸气急剧的将锅内冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内压力，从而使沸点增高，获得高于100°C的温度，导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的目的。

具体步骤：①.加水②装料③加盖④排气⑤升压⑥保压⑦降压⑧无菌检查

7如何制备大肠杆菌感受态细胞？

答：感受态细胞就是细菌最容易实现转化的状态。感受态细胞可以通过理化因素诱导产生，其中制备大肠杆菌感受态最常用的方法是CaCl2法。将细胞置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞会膨胀成球形，细胞膜的通透性会发生改变。此外还可以应用PEG法和电击法，其中电击法可以实现大肠杆菌较高效率的转化。

步骤：1、挑取大肠杆菌新鲜菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取0.2ml培养液于含50mlLB培养液的三角瓶中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4，于冰水中迅速冷却。

3、菌液置预冷的离心管中冰浴15min，于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，加入预冷MgCl2-CaCl2溶液20ml，于冰水中放置15min。

4、于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，用预冷CaCl2溶液2ml悬浮菌体。于冰水中放置15min，分装至离心管中，每管200ul。

8简述移液管和培养皿的包扎注意事项

答：1、培养皿：包扎前洗净烘干，包扎时每10套迭在一起，用牛皮纸包扎后再用绳子捆扎，防止分散开。

2、移液管：包扎前洗净烘干，在孔吸的一端塞入少许脱脂棉，防止菌体误吸入口中及口中的微生物吸入管而进入培养物造成污染，塞入棉花量要适宜，不宜露在管口外面；包扎时，卷纸成45°卷起，并包扎好，以防散开。

9 NTG诱变的机理以及诱变的步骤。简述每一步操作的理由

答：NTG为烷化剂的一种，其存在多个活性烷基，可以烷化磷酸基、嘌呤、嘧啶等而与DNA发生作用。其中鸟嘌呤N7是最容易起反应的位点。烷化后的鸟嘌呤易于离子化，由原来的酮式变为不稳定的烯醇式，从而与胸腺嘧啶配对而不与胞嘧啶配对，造成GC-AT转换。此外，NTG还可以引起染色体小范围切除、移码突变及GC对的缺失等突变。另外据认为NTG的作用是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。

步骤（以黑曲霉为例）：1、单孢子悬液制备：取斜面，加入6ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管并过滤，制得单孢子悬液，使孢子良好分散，为诱变做准备。

2、NTG溶液制备：精确称取2mgNTG，加入2ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，,与暗处震荡溶解，防止NTG分解。

3、诱变处理：吸取NTG液1ml，加入到1ml孢子悬液中，30℃震荡30min，稀释1000倍停止作用，然后以10-2和10-4两个稀释度分离培养，30℃，3d后计数。

4、死亡率计算：将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃培养3d，根据前后处理活孢子数计算死亡率。

5：筛选目标菌株。

10微生物紫外线诱变后应如何培养？为什么？

答：UV诱变后应在红光下进行后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

原因：微生物经UV诱变后，如果立即暴露在可见光下，出现明显降低死亡率的现象即光复活作用。微生物经紫外照射后，DNA分子中会产生嘧啶二聚体，造成局部DNA分子无法配对，引起微生物死亡或突变。为这种二聚体会在黑暗下被光解酶结合，这种复合物在可见光下被激活，使二聚体重新分解成单体，从而降低了微生物的死亡率或突变率。

2006微生物实验操作复试

5如何测量酿酒酵母的大小？

答：酿酒酵母个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具——测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台

测微尺和接目测微尺。镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。

由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。

操作步骤

1.装接目测微尺：取下显微镜的目镜，换上专用目镜。如果没有专用的目镜，则取下显微镜的目镜，旋下透镜，

将接目镜测微尺刻度朝下放在接目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜筒。

2.接目测微尺的标定：

1)放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上固定在显微镜的载物台上，注意不可放反。

2)标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微

尺的刻度后，转动目镜使接目测微尺与镜台测微尺的刻度相平行。利用移动钮移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和接目测微尺所占的格数。（使接目测微尺的一条刻度线与镜台测微尺的一条刻度线相重合，再寻另一重合线，分别数出其间镜台测微尺和接目测微尺所占的格数）

3)用同样的方法，在高倍镜下对接目测微尺进行标定。（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺

的刻度，换高倍镜标定时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头）

4)计算：已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，接目测微尺每

格所代表的长度。

接目测微尺每格长度（μm）=10n/m

n：两重合线间镜台测微尺格数

m：两重合线间接目测微尺格数

3.微生物细胞大小的测量

接目测微尺标定完毕后，取下镜台测微尺，换上微生物标本片，将其固定在载物台上，先用低倍镜找到标本片图象，然后根据不同的微生物对象分别转换到高倍镜下，用接目测微尺测量微生物细胞的直径或宽和长所占的格数，再依据所标定的高倍镜每一格的实际长度计算细胞的实际大小。

通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小，为了尽量减小实验误差，应在同一标本片上测量10~20个细胞，取其平均值作为该菌的大小。

维护：测量完毕，换上原有显微镜目镜（或取出接目测微尺，目镜放回镜筒），用擦镜纸将测微尺擦拭干净后放回盒内保存，并按照显微镜的使用和维护方法擦拭物镜。

6有哪些生理生化反应能够用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌？

答：有吲哚试验、柠檬酸试验、V.P.试验和甲基红试验等。

吲哚实验:有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气杆菌阴性。

甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲酸、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4.2（红色）—6.3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。

V.P.试验：某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V.P.反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。产气杆菌V.P.反应阳性，大肠杆菌V.P.反应阴性。

柠檬酸盐试验：有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，使培养基pH升高，在有１％溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pＨ小于6.0时呈黄色，pＨ在6.0-7.6时为绿色，p Ｈ大于7.6时呈蓝色。

9简述移液管使用方法和注意事项

1、使用前：使用移液管，首先要看一下移液管标记、准确度等级、刻度标线位置等。使用移液管前，应先用铬

酸洗液或蒸馏水润洗，以除去管内壁的油污。然后用自来水冲洗残留的洗液，再用蒸馏水洗净。洗净后的移液管内壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端内外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2至3次，以确保所移取溶液的浓度不变。

2、吸液：用右手的拇指和中指捏住移液管的上端，将管的下口插入欲吸取的溶液中，插入不要太浅或太深，一般为10～20mm处，太浅会产生吸空，把溶液吸到洗耳球内弄脏溶液，太深又会在管外沾附溶液过多。左手拿洗耳球，先把球中空气压出，再将球的尖嘴接在移液管上口，慢慢松开压扁的洗耳球使溶液吸入管内，先吸入该管容量的1/3左右，用右手的食指按住管口，取出，横持，并转动管子使溶液接触到刻度以上部位，以置换内壁的水分，然后将溶液从管的下口放出并弃去，如此用反复洗3次后，即可吸取溶液至刻度以上，立即用右手的食指按住管口。

3、调节液面：将移液管向上提升离开液面，管的末端仍靠在盛溶液器皿的内壁上，管身保持直立，略为放松食指（有时可微微转动吸管）使管内溶液慢慢从下口流出，直至溶液的弯月面底部与标线相切为止，立即用食指压紧管口。将尖端的液滴靠壁去掉，移出移液管，插入承接溶液的器皿中。

4、放出溶液：承接溶液的器皿如是锥形瓶，应使锥形瓶倾斜30°，移液管直立，管下端紧靠锥形瓶内壁，稍松开食指，让溶液沿瓶壁慢慢流下，全部溶液流完后需等15s后再拿出移液管，以便使附着在管壁的部分溶液得以流出。如果移液管未标明“吹”字，则残留在管尖末端内的溶液不可吹出，因为移液管所标定的量出容积中并未包括这部分残留溶液。

1．移液管(吸量管)不应在烘箱中烘干。

2．移液管(吸量管)不能移取太热或太冷的溶液。

3．同一实验中应尽可能使用同一支移液管。

4．移液管在使用完毕后，应立即用自来水及蒸馏水冲洗干净，置于移液管架上。

5．移液管和容量瓶常配合使用，因此在使用前常作两者的相对体积校准。

6．在使用吸量管时，为了减少测量误差，每次都应从最上面刻度（0刻度）处为起始点，往下放出所需体积的溶液，而不是需要多少体积就吸取多少体积。

7、检查移液管的管口和尖嘴有无破损,若有破损则不能使用。

8如果移液管上标有“吹”字，则最后残留在管内的液滴必须吹出。

9如果移液管是从不能确认洁净的移液管架上所取；不能确认洁净的移液管，应清洗移液管。

10使用完移液管，清洗移液管内外壁，再放回洁净的移液管架。

11清洗、移液过程中溶液不要滴到桌面、地面。

10如何制作斜面培养基,简述具体步骤并说明注意事项

答：具体步骤：1.玻璃器皿洗涤并包扎灭菌。

2.固体培养基的配置：先将配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂（1.5%-2.0%）加入，并使用玻璃棒搅拌，以免糊底烧焦。加热使琼脂融化，最后补足因蒸发而失去的水分。

3.分装培养基：去玻璃漏斗，装铁架台上，漏斗下连橡皮管，再连玻璃管。倒入培养基并使其流入试管内，装入量为管高的1/5。注意不要使培养基沾污管口，造成污染。

4.制作棉塞：选用大小、厚薄适中的棉花，塞入试管口，应紧贴管壁，不留缝隙，以棉塞2/3在管内为宜。塞好棉塞后，将试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。标记培养基名称及配置日期。

4.培养基灭菌：分装好的培养基进行高压蒸汽灭菌。

5.制作斜面：灭菌后的培养基趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面，斜面长度不超试管长度1/2为宜。

2007微生物实验操作复试

1哪些方法可以提高视野中光的强弱？

答：显微镜的光学系统中有反光镜、激光器、光源等。

（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。（2）聚光镜：位于载物台的下方，由两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。通过调节聚光镜调旋钮，可以调节光的强弱；聚光器还附有虹彩光圈，调节锥形光柱的角度和大小，从而控制进入物镜的光的量，从而调节光的强弱。

（3）光源：日光和灯光均可作为光源。通过使用不同的光源改变视野中光的强弱。

2用美蓝染色法对酵母细胞进行死活鉴别时为什么要控制染液的浓度和染色时间？

答：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原性，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原性的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的老龄细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行辨别。加入美蓝浓度高了或染色时间太长了，代谢不太活泼的活细胞也会被染色，从而使视察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。

2008微生物实验操作复试

2009微生物实验操作复试

2高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？

答：湿热灭菌比敢惹灭菌效果好，主要原因有①.在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。因此，高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短。

3革兰氏染色液成分以及各种成分的作用

答：①.革兰氏染色液成分：结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红液

作用：结晶紫染液：使细胞被染成蓝紫色。

碘液：作为媒染剂，能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

95%乙醇：乙醇可以使细胞壁脱水，类脂溶解，从而增加了细胞壁的通透性，结晶紫-碘的复合物容易被洗出。

番红：使细胞被染成红色。

4如何测量大肠杆菌大小？

9 为使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个步骤？

1 无菌操作

2 稀释良好，不会太浓或太稀。

3 平板涂布均匀，菌落生长时间控制好，不会长的太大不便区分，也不至于太小影响计数。

10配制培养基的基本步骤和注意事项

1、玻璃器皿的洗涤并包扎灭菌。

2、配制液体培养基：称量、溶解、定容、调pH、过滤。

3、固体培养基的配制。

4培养基的分装：根据不同需要，将配好的培养基分装入试管或三角瓶内。

5、棉塞的制作和试管、三角瓶的包扎。

6、培养基的灭菌。

7培养基的灭菌检查。

2010微生物实验操作复试

．显微镜的放大倍数：物像大小对物体大小的比例。显微镜的放大倍数等于目镜的放大倍数和物镜放大倍数的乘积。放大倍数指的物体的宽度和长度的放大倍数，而不是面积和体积的放大倍数。

3．镜头长度与放大倍数的关系：目镜的长度与放大倍数成反比，物镜的长度与放大倍数成正比。

4．物像移动与装片移动的关系：由于显微镜下成的像是倒立的像，所以，物像移动的方向与载玻片移动的方向是相反的。

5．放大倍数的变化与视野进而细胞数量变化的关系。

第一种情况：一行细胞数量的变化，可根据放大倍数与视野成反比的规律计算。

第二种情况：圆形视野范围内细胞数量的变化，可根据看到的实物范围与放大倍数的平方成反比的规律计算。

对于一株未知菌株进行革兰氏染色时,怎样确定你的染色技术正确,结果可靠

革兰氏染色的成功和实验时的环境条件有很大关系，同样的实验参数，比如染色时间、水洗时间、复染时间等在不同的环境下染色的效果是不同的。那么对未知菌进行染色法鉴定其革兰氏阴性/阳性时，必须同时在同一个载玻片上做上阳性对照和阴性对照。阳性一般选择枯草芽孢杆菌，阴性一般选择大肠杆菌，因为比较常见. 如果实际染色结果和理论结果相符则得出的染色结果就应该是比较可靠的了。

酵母菌的假菌丝是怎样形成的?它与真菌丝有何区别？

假菌丝：酵母菌进行出芽生殖时，子母细胞不立即分离而以狭小的面积相连，则称这种藕节状的细胞串为假菌丝。假菌丝没有横隔。各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状，在分隔处缢缩。假菌丝与真菌丝明显不同处在于其两细胞间有一细腰，而不象真正菌丝横隔处两细胞宽度一致。

使用油镜时，应该特别注意哪些问题？

1、采用油镜除需要在标本与镜头之间滴加香柏油。

2、注意油镜焦距极短，切勿使镜头触及载玻片而受损。

3、使用油镜观察时，需采用强光观察。

4、镜检完毕，需用擦镜纸擦拭镜头香柏油，再蘸取二甲苯清洁镜头并擦拭。

对同一微生物制片，用油镜观察比用低倍镜观察有何优缺点？

对同一微生物制片，油镜分辨率更高，是目标物观察的更清楚；但在操作方面，油镜观察相对低倍镜较繁琐，对较大的微生物菌体，油镜无法观察其全貌。

为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时

一般微生物，应选用培养16-24小时为宜，因为若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏染色阳性菌转为阴性反应，使得显微镜下出现假阴性现像。

血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差,力求准确?

血细胞计数板计数的误差主要有系统误差和偶然误差。其中由于操作人员，器材处理、使用不当，稀释不准确等因素所造成的误差属偶然误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称系统误差。具体有：1、所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求；2、菌悬液稀释度不适，菌液混合不均匀，造成计数困难。3、由于操作不当，计数室产生气泡，造成计数不准。4、操作人员计数过程中，由于细胞识别不准，计数方法错误等，造成计数不准。

能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数

不行。由于血球计数板较厚，用油镜观察时，计数板下部的细菌不易看清。其次，用油镜观察时需要采用强光，强光下有可能看不清计数格的边界线以及菌体细胞。

为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花, 再用报纸包，经高压蒸汽灭菌后才能使用?

为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞才能使用?

棉塞的作用有二：其一是防止杂菌污染，其二是保持瓶内氧气流通。

配制培养基时为什么要调节pH?

从整体来看，各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，如细菌为7.0-8.0，放线菌为7.5-8.5，酵母菌为3.8-6.0，霉菌为4.0-6.0等，因此，依照不同微生物的培养目的，需要对培养基进行pH调节。但是培养物的代谢作用又会改变培养基的pH，所以在配置培养基时，不仅培养基的起始pH值应符合微生物的要求，而且要考虑采用何种缓冲作用保持其pH值。例如，一般在培养产酸的微生物时可在培养基中加入适量的CaCO3，以中和不断产生的酸。

为什么融化后培养基要冷却到45℃左右方可倒平板，过冷或过热行不行？为什么？

1、融化后的培养基温度较高，不经冷却就倒入冷的平板中，则会产生水汽和水滴附着表面壁上，甚至融液的溅出，影响涂布效果。

2、培养基温度过高，在倾倒培养液时烫手，同样影响实验的顺利操作。

3、温度过低琼脂会凝固，倒出来的板子不平，形成果冻样块状，如果形成气泡不容易排除，形成气洞。

V.P.反应中加入NaOH溶液的作用是什么

V.P.实验中，丙酮酸缩合、脱羧生成的3-羟基丁酮，需要在碱性条件下才能被空气氧化成二乙酰。NaOH为反应的顺利进行提供碱性环境。

为什么在诱变前要把菌悬液打散

使菌种分散，与培养液充分混合，有利于菌种复苏生长，进入对数生长期；另外也使菌液均质，有利于紫外光的均匀分布处理。

试述紫外线诱变的注意事项

1、注意诱变过程中，在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

2、为了使细胞均匀接受照射，培养皿应在无盖条件下直接照射，同时用电磁搅拌棒或者其他方法均匀旋转并搅动悬液

3、紫外光对生物细胞有较强的杀伤作用，亦是物理致癌因子之一，使用时应注意防护，操作尽量控制在防护罩内。

简述诱变后后培养的目的及注意事项

后培养是指诱变处理后，立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯和并表达。1、遗传物质经诱变处理后发生改变，必需经过DNA的复制才能稳定成突变基因，而突变基因则要经过转录和蛋白质的合成才能表达，呈现突变型表型。后培养所用培养基营养丰富，有利于突变微生物基因转录和蛋白质合成。2、后培养可以消除表型延迟。经过后培养及之后的分离筛选，有利于找出突变型个体。

注意事项：后培养需要黑暗条件下进行，防止紫外诱变后微生物光复活。2、后培养的培养基必需营养丰富，需含有足量的氨基酸和嘌呤嘧啶碱基等。

加入溶液Ⅱ后为什么不能剧烈震荡

加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则，染色体DNA 会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。

质粒DNA在琼脂凝胶电泳时,泳动速度的影响因素有哪些

1、核酸的性质

核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA 分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型>线性>单链开环型。

对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电泳分离纯化单链核酸。

2、凝胶孔径的大小：

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段（5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA 片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素，它决定了能被分离的片段的大小。

3、电场强度和电场方向：

低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。

4、电泳环境

缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE 中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。

如何筛选融合子？

1、利用营养缺陷型标记筛选融合子：这是一种常见而有效的传统的选择标记方法，其检出设计的原则是将亲本菌株诱变处理后产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株。在分离的培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合子。

2、利用抗药性标记筛选融合子：微生物的抗药性是菌种的重要特性!是由遗传物质决定的，不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异!利用这种差异即可对融合子进行选择。

3、利用荧光染色法筛选融合子：荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素，然后在显微操作器和荧光显微镜下挑取，同时带有双亲原生质体荧光标记的融合子，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合子。

4、利用灭活原生质体标记筛选融合子：这项技术的原理是在原生质体融合之前对单亲或双亲原生质体进行灭活，使其丧失再生的能力。当与另一亲株融合后，代谢上得到互补能够存活。

4、利用形态差异选择融合子：这一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接观察的形态学差异!

原生质体操作时为什么要选用高渗培养基

由于原生质体是微生物菌体去除细胞壁厚制备的，对渗透压非常敏感，只有出于高渗环境中才能避免吸水膨胀而破裂，所以原生质体操作时要选用高渗培养基。使其保持高渗环境。

pUC19特点

pUC18、pUC19载体适合于DNA片段的克隆、进行DNA测序、对外源基因进行表达等。由于在lacZ 领域中含有多克隆位点，因此在以lacZ缺欠细胞作为宿主(如：JM109等) 进行转化后，在含有IPTG、X-Gal 的平板培养基上进行培养时，可以很容易地通过兰白筛选，判断载体中有无DNA片段的插入。同时还可以通过载体上的lac promoter表达外源基因，对插入载体中的DNA片段进行测序等。进行DNA测序时，可以方便地使用M13系列的通用引物