分子生物学考试重点

分子生物学考试宝典

名词解释

1. 基因：是编码RNA或一条多肽链的DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列

插入序列。

2. 基因组：细胞或生物体内一套完整单倍体的遗传物质的总和。

3. 结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列，包括模板链和编码链。

4. 基因表达：生物基因组中的结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等过程合成特定蛋白质，进而发挥特定生物学功能和生物学效应的全过程。

5. 开放阅读框（ORF）：在mRNA的核苷酸序列中，包含特定蛋白质多肽链信息的序列，从起始密码子开始到终止密码结束，决定了蛋白质的一级结构，该段序列称为开放阅读框或蛋白质编码区。

6. 非编码区（UTR）：是位于开放阅读框的5’端上游和3’端下游的没有编码功能的核苷酸序列。其主要功能是参与翻译起始调控，是翻译的必需序列。

7. 卫星DNA:是出现在非编码区的串联重复序列，其特点是具有固定的重复单位，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。包括，大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。

8. 微卫星DNA：又称为短串联重复（STR），是一类更为简单的寡核苷酸串联重复序列，其重复单位为2～6bp，重复次数10～60次左右，其总长度通常小于150bp，分布在所有的染色体。微卫星DNA 因为重复单位的重复次数不同而具有高度的遗传多态性，并且按照孟德尔遗传规律，可以作为很好的遗传标记。

9. 动态突变：微卫星序列的串联重复的拷贝数可发生改变，并可随世代的传递而扩大，称为动态突变。可与一些遗传病和肿瘤发生有关。

10. 反向重复序列：是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。两个反向序列间可以有间隔序列，也可以串联在一起（回文结构）。反向重复序列常见于基因的调控区内，可能与复制、转录的调控有关。

11.限制性片段长度多态性（RFLP）：指用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，由于高度重复序列和点突变的存在，会得到长度、数量各不相同的限制性片段类型。

12. 分子克隆：在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。

13. 基因工程：有目的地通过分子克隆技术，利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构的系列过程。

14. 载体：能够携带外源基因进入受体细胞，并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的DNA分子。

15. 基因组学：意指阐明整个基因组的结构，结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。

16. 功能基因组学：研究基因组中的所有基因功能的学科，是从基因整体水平上对基因的活动规律进行探讨。研究内容包括：基因组的表达，蛋白质产物的功能，基因组多样性的研究，基因组功能注释。

17. 蛋白质组学：研究细胞或机体全部蛋白质表达及其活动方式，包括：翻译后修饰，转运定位，结构变化，蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等的一门学科。

18. 操纵子：原核生物数个功能相关联的结构基因串联在一起构成信息区，连同其上游的调控区以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，其转录产物为多顺反子。

19. 操纵元件：是一段能够被不同基因表达调控蛋白识别和结合的DNA序列，是决定基因表达效率的关键元件。

20. 启动子：是RNA聚合酶特异识别和结合并启动转录的DNA序列。包括识别序列部位、结合部位、起始部位。

21. 增强子：位于真核基因中远离转录起点，能够明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列，它可以位于被增强的转录基因的上游或下游，作用无方向性和基因特异性（但有组织特异性），也不受基

因间距离远近的影响。

22. 衰减子（attenuator）：位于一些操纵子中第一个结构基因之前的一段能够减弱转录作用的DNA 序列。

23. CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白。这种蛋白可以将葡萄糖饥饿信号传递给许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖是可以利用其他碳源。

24. 转座子（transposon，Tn）：是细菌细胞里发现的一类除携带与转座作用有关基因外还携带有其他基因（如耐药基因，重金属抗性基因等）的转位因子。其两端侧翼序列是两个反向重复序列（IS）。可在细菌染色体、质粒和噬菌体基因组之间转移，是细菌耐药基因播散的机制。

25. 逆转录转座子（retroposon）：真核生物中的一些中度重复序列的转移成分要先转录成RNA，再逆转录成cDNA，然后重新整合到基因组中，这种逆转录旁路的转移成分称为逆转录转座子。

26. SD序列：在位于原核生物mRNA起始密码AUG上游10碱基左右，有一段富含嘌呤的序列，这一序列以…AGGA…为核心，成为SD序列。该序列能与核糖体30s小亚基中16s rRNA 3’端

2 分子生物学考试宝典（私房版）

富含…UCCU…序列互补，是核糖体特异识别和结合的部位。

27. 管家基因：在生物体生命全过程都是必须的，且在一个生物个体几乎所有细胞都持续表达的基因。

28. 多基因家族：指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的基因，其编码产物常常具有相似的功能。

29. 假基因（pseudogene）：指与某些有功能基因结构相似，但不能表达基因产物的基因。

30. 癌基因：是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可以使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。

31. 细胞癌基因：存在于正常细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。特点：1）存在广泛；2）高度保守；3）原癌基因是必需基因，产物有重要功能；4）在某些因素作用下可发生突变，成为癌基因。

32. 病毒癌基因：存在于病毒（大多数是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是受到外界条件激活时可以产生诱导肿瘤发生的作用。

33. 抑癌基因：存在于正常细胞内的一大类抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可以引起细胞恶性转化，从而导致肿瘤的发生。

34. 凋亡：是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序性死亡过程，它的发生受机体的严密调控。

35. 细胞周期蛋白：是一类随细胞周期的变化呈周期性出现与消失的蛋白质，可分为A、B、C、D、E等几大类，它们可在细胞周期的不同阶段相继表达，与CDK蛋白结合后，参与细胞周期相关活动的调节。

36. 周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）：是一类可以与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚单位，进而表现出蛋白激酶活性的蛋白质。

37. 周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CDKI）：是对CDK激酶起负性调控作用的蛋白质。它们在细胞周期的不同检测点或与CDK单独结合，或与Cyclin-CDK复合物结合，形成不同的屏障。其本身也可通过细胞周期中特异性的降解或失活作用，调控细胞通过细胞检查点。CDKI分为CIP/KIP家族和INK 家族。

38. 转化（transformation）：质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。

3 分子生物学考试宝典（私房版）

39. 转导（transduction）：以噬菌体为媒介，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。

40. 转染（transfection）：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

41. 感染：以噬菌体、粘粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，进而感染适当细胞并在其内扩增的过程。

42. DNA变性：在理化因素作用下DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。两条链间的氢键断裂而核酸分子所有的共价键不受影响。

43. DNA复性：促使变性的因素解除后，两条DNA链通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。

44. 端粒（telomere）：是位于真核生物染色体末端的，由DNA和蛋白质组成的一膨出结构。端粒DNA 由短的高度重复序列组成，重复序列在DNA复制过程中正常复制，部分由端粒酶延伸。

45. 反式作用因子：是真核细胞中含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。（反式作用因子的三个基本特征：①一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域；②能识别并结合顺式作用元件；③对基因表达有正性和负性调控作用。）

46. 顺式作用元件（cis-acting element）：是指那些与结构基因串联在一起，与结构基因表达调控相关，能够被基因调控蛋白特异识别和结合的DNA序列。包括：启动子、上游启动元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

47. 锌指结构：是指在结合DNA的结构域中含有较多的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）的区域，借肽链的弯曲使2个Cys 和2个His或4个Cys与一个锌离子络合成的指状结构。具有锌指结构的反式作用因子都含有几个相同的锌指结构。

48. 亮氨酸拉链（leucine zipper）：有些反式作用因子结合DNA结构域中有一段约30个氨基酸组成的核心序列，每个6个氨基酸残基有规律的出现1个亮氨酸残基，能够形成两性α-螺旋，一端为富含碱性氨基酸的亲水的碱性区域，一端为成行亮氨酸构成的疏水区（亮氨酸拉链区），两个具有亮氨酸拉链区的单体以疏水力相互作用就形成了亮氨酸拉链。

49. 转基因动物：是指基因组中整合有人工导入的外源基因、外源基因能够表达并按孟德尔定律遗传的一类动物。

50. 嵌合体（chimera）动物：体内含有两种或两种以上基因组细胞的动物；在转基因动物中，指体内部分组织细胞中整合有外源基因的动物。

4 分子生物学考试宝典（私房版）

51. 蛋白激酶：能够将γ-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。

52. 蛋白磷酸酶：具有催化已经磷酸化蛋白发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。对蛋白质激酶所引起的变化产生衰减信号。

53. 丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）：属于蛋白丝/苏氨酸激酶，是接收膜受体转换与传递的信号，并将其带入细胞核的一类分子。未受刺激细胞内MAPK无活性，可因逐级磷酸化反应而激活。

54. 核酶：是一种可以催化RNA切割和RNA剪接反应的由RNA组成的酶。可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。

55. 基因敲除：指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程。

56. 基因打靶：通过DNA定点同源重组，改变基因组中某一特定基因，从而在生物体内研究该基因功能。

57. 基因诊断：以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接监测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

58. 核酸分子杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链。其实质是，核酸变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。

59. 反义核酸技术：是通过合成一种与目标DNA或RAN特异性互补的反义核酸片段，来干扰目标基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。

60. DNA芯片技术：在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式

有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）的技术，常用计算机硅芯片作为固相支持物。

61. PCR/单链构象多态性分析（SSCP）：PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的由于构象的不同因而迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在，常用于点突变的检测。

62. 基因连锁分析：将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法。

63. 三链DNA:一些DNA或RNA寡核苷酸片段能特异结合在的DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键，这样的结构称为三链DNA。

64. 信息分子：携带生物信号，在细胞之间进行传递的小分子化学物质。又称为第一信使。

5 分子生物学考试宝典（私房版）

65. 受体：靶细胞中能够特异性结合外源信号分子，并将信号传至细胞内产生生物效应的蛋白质。与受体呈特异性结合的信号分子称为配体。受体可分为膜受体和细胞内受体，其作用特点是：高度特异性，高亲和力，可饱和性，可逆性，放大效应

66. G蛋白：即鸟苷酸结合蛋白，是由α、β、γ三个亚基构成的异源三聚体，另一类G蛋白为小分子单体G蛋白。G蛋白具有结合GDP或GTP的能力，并有催化GTP成GDP的活性，广泛存在各种组织细胞膜上，在受体和效应蛋白间起传递信息的作用。

67. YAC(酵母人工染色体)：是由酵母染色体和质粒的一部分构建而成，包含了中心粒、端粒、复制元件和筛选标记等序列。这种载体能插入大片段DNA，一般认为携带1Mb的插入片段，主要是用来构建大片段DNA 文库。

68. 粘粒（cosmid）：是由大部分质粒序列包括复制原点、抗性标记等和噬菌体的cos粘端序列构建而成，可携带较长的DNA插入片段（40～50kb）。粘粒可以像噬菌体一样被包装成λ粒子。

69. 探针：指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，具有特定的序列，能与待测核酸片段互补结合，可用于检测核酸样品中的特定基因。可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。

70. 基因治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。

6 分子生物学考试宝典（私房版）

问答题

一、病毒、原核、真核基因组的特点

1.病毒基因组

1）病毒基因组较小，是单倍体；

2）形式多样：病毒基因组有的是DNA，有的是RNA，但只含一种核酸。结构上可以是双链、单链、环状、线性分子；

3）RNA病毒基因组可以是数条不相连的RNA链组成：如流感病毒基因组RNA有8个RNA分子组成；4）存在基因重叠：不仅存在结构基因重叠，也存在编码区和调控区重叠；

5）可形成多顺反子mRNA；

6）噬菌体基因连续，而真核细胞病毒基因是不连续的。

2.原核基因组

1）通常由环状双链DNA分子组成，只有一个复制起点；

2）具有操纵子结构，转录产物为多顺反子；

3）绝大多数为单拷贝（编码rRNA的基因有多个拷贝）；

4）编码区所占比例较大（大于真核小于病毒），且重复序列很少；

5）含有编码同工酶的同基因；

6）不同原核生物基因组GC含量变化大，可用于鉴别细菌种类；

7）细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象；

8）细菌染色体外存在质粒DNA。

3.真核基因组

1）真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，有多个复制起点；

2）由染色体DNA和线粒体DNA组成；

3）非编码序列多于编码序列，编码序列仅占3％左右；

4）存在大量重复序列；

5）结构基因多为断裂基因，有内含子和外显子组成；

6）转录产物为单顺反子；

7）存在多基因家族和假基因；

8）体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。

7 分子生物学考试宝典（私房版）

二、DNA损伤因素及机制

1.紫外线引起DNA损伤

1）形成胸腺嘧啶二聚体，影响双螺旋结构，使复制和转录受阻；

2）引起DNA间交联，DNA与蛋白质交联，甚至DNA链断裂。

2.电离辐射引起DNA损伤

1）导致碱基变化：电离辐射产生的自由基可导致碱基氧化修饰、过氧化物形成、碱基破坏和脱落；2）导致脱氧核糖变化：自由基导致脱氧核糖分解；

3）导致DNA链断裂：直接或间接使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA断裂；

4）引起DNA交联：包括DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联。

3.烷化剂引起DNA损伤

1）导致碱基烷基化，影响碱基配对；

2）导致碱基脱落，造成子代DNA序列改变；

3）导致DNA链断裂；

4）导致DNA交联。

4.碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变

5.DNA自发损伤

1）复制时产生碱基错配；

2）修复时产生碱基错配；

3）碱基自发改变导致DNA损伤：如互变异构移位、脱氨基、碱基丢失。

6.其他因素：如吖啶类化合物的插入，生物氧化的自由基与DNA发生加成和小自由基反应等。

三、DNA的损伤修复机制

1.直接修复

1）一些DNA断裂口在连接酶作用下可直接修复；

2）二聚体可被光复活酶直接修复；

3）烷基化碱基可通过O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶、Ada酶直接修复。

2.切除修复

1）单个碱基切除修复：特定DNA糖苷酶识别并切除受损碱基→AP核酸内切酶在无碱基部位将DNA 链的磷酸二酯键切开→外切核酸酶

8 分子生物学考试宝典（私房版）

切除脱氧核糖残基→DNA聚合酶和连接酶修复缺口；

2）核苷酸片段切除修复：先由一个酶系统识别损伤部位，然后在损伤两侧各水解一个磷酸二酯键，释放一段核苷酸，最后在DNA聚合酶和连接酶修复损伤区。

3.重组修复：是DNA损伤较多时采取的修复方式，是先进行复制再进行切除修复。包括同源重组和非同源重组。

4.SOS修复：是DNA损伤严重时的应急性修复方式，人类细胞未发现这种修复系统。

5.细胞周期检查点控制：这是真核生物诱导修复的主要机制，通过该机制可以诱导修复基因转录，

或暂时阻断细胞周期，或诱导细胞凋亡。

四、基因突变的遗传效应

1.基因突变引起遗传密码的改变：发生碱基取代、缺失、插入都会引起DNA碱基组成和排列顺序的改变，但就转录、翻译合成蛋白质而言，基因突变会产生多种遗传效应。

1）错义突变：因为DNA分子中碱基的取代，导致转录翻译后蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生改变。

2）无义突变：由于碱基被取代、缺失或插入，使原来的氨基酸密码子变成终止密码子，翻译后形成一条切短了的、不完全的多肽，使蛋白质生物活性和功能发生改变。

3）同义突变：虽然基因结构中有碱基取代，但由于遗传密码的简并性，而不引起蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生任何改变。

4）移码突变：基因碱基序列中发生单个核苷酸、数个核苷酸的缺失或插入，或核苷酸片段的缺失或插入，导致突变区域后的阅读框移位。如果插入或缺失核苷酸是3的整数倍，合成多肽链就会增加或减少一个或数个氨基酸。如果插入或缺失核苷酸不是3的整数倍，突变区域后合成的氨基酸将完全改变，还重新产生终止密码子，影响多肽长度，严重影响蛋白质的结构、理化性质和生物功能。

2.基因突变影响hnRNA的剪接：如果真核生物基因突变发生在hnRNA的剪接位点上，导致剪接位点消失或产生新的剪接位点都将导致蛋白质表达产物的异常，改变相应的生物性状。

五、原核、真核基因表达特点

1.原核：1）操纵子模型普遍性；2）阻遏蛋白与阻遏机制普遍性；3）σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；4）转录和翻译过程耦联，产物为多顺反子；5）仅一种RNA聚合酶，转录所有基因；6）tRNA 和rRNA前体需要加工修饰，mRNA不需加工就可直接作为蛋白质合成模板；7）起始tRNA

9 分子生物学考试宝典（私房版）

携带的是甲酰蛋氨酸（fMet）可有多个起始部位，同时合成不同蛋白；8）核糖体直接结合到AUG 部位

2.真核：1）转录和翻译分开，产物为单顺反子，转录产物需进行加工；2）转录激活主要受顺式作用元件和反式作用因子相互作用调节；3）有3种RNA聚合酶，分别转录不同RNA；4）起始tRNA 携带的是蛋氨酸，就一个起始部位；5）核糖体结合与“帽子”结构，扫描找到AUG。

六、乳糖操纵子的作用机制

乳糖操纵子（lac operon）含Z、Y、A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶。结构基因上游有一个操纵元件（O）和一个启动子（P），启动子上游有一个CAP（分解代谢物基因激活蛋白）结合位点。启动子、操纵元件和CAP结合位点共同构成了Lac操纵子的调控区。I基因是调节基因，可编码产生阻遏蛋白，在没有乳糖的条件下与操纵元件结合，操纵元件与启动子有部分重叠，从而抑制结构基因的转录。

在乳糖存在时，乳糖经透酶作用进入细胞，在由β-半乳糖苷酶催化生成半乳糖。半乳糖可作为诱导剂与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白构象改变与操纵元件解离，解除对结构基因转录的抑制。

Lac启动子是弱启动子，与RNA聚合酶结合能力弱，需要CAP对其进行正调控。当环境中由以葡萄糖为主转变为以乳糖为主要碳源时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，从而可以与CAP结合位点结合，激活RNA聚合酶活性，启动结构基因转录，加速合成分解乳糖的3种酶。

七、色氨酸操纵子的作用机制

色氨酸操纵子（trp operon）是一种阻遏型操纵子，含E、D、C、B、A五个结构基因，编码色氨酸合成相关酶。上游调控区由启动子（P）和操纵元件（O）组成。R是调节基因，编码阻遏蛋白，在细胞内有大量色氨酸存在时与操纵元件结合，抑制转录，无色氨酸时则不结合，启动转录。

trp操纵子的另一个调控方式是衰减机制调节。衰减子位于结构基因E和操纵元件之间的L基因中。衰减子转录物有片段1、2、3、4四个序列互补区，相邻之间可形成发夹结构。3、4形成发夹结构后紧跟着寡尿嘧啶，是不依赖ρ因子的转录终止信号。L编码的14个氨基酸短肽序列中有两个相邻的色氨酸密码子，位于片段1内。由于细菌转录翻译偶联，当细胞中有色氨酸时可以形成色氨酰-tRNA，核糖体可迅速通过相邻两个色氨酸位点，封闭片段2，致使片段3、4

10 分子生物学考试宝典（私房版）

形成发夹结构，终止转录。当细胞中色氨酸缺乏时，核糖体就滞留在两个色氨酸密码子位点，片段

2、3可形成发夹结构，不影响结构基因的继续转录。

八、反式作用因子结构域，模体及其特点

反式作用因子一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域。与DNA 结合的模体主要有：

1.锌指结构：该结构域中含有较多的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）的区域，借肽链的弯曲使2个Cys 和2个His或4个Cys与一个锌离子络合成的指状结构。具有锌指结构的反式作用因子都含有几个相同的锌指结构，每个指结构的指尖部分可以进入DNA双螺旋的大沟或小沟。

2.同源结构域：很多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段60左右个氨基酸组成的保守的螺旋-回折-螺旋结构区域，称为同源结构域，其螺旋区域能够进入DNA双螺旋的大沟，与碱基结合。

3.亮氨酸拉链：有些反式作用因子结合DNA结构域中有一段约30个氨基酸组成的核心序列，每个6个氨基酸残基有规律的出现1个亮氨酸残基，能够形成两性α-螺旋，一端为富含碱性氨基酸的亲水的碱性区域，一端为成行亮氨酸构成的疏水区（亮氨酸拉链区），两个具有亮氨酸拉链区的单体以疏水力相互作用就形成了亮氨酸拉链，其碱性区域可以结合DNA。

4.螺旋-环-螺旋（HLH）：这种结构能形成两端具有兼性的α-螺旋，螺旋间由不同长度的环连接。紧靠螺旋区N端有一段富含碱性氨基酸的序列可与DNA结合。含有该结构的反式作用因子（如与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的E12和E47）易通过螺旋区形成二聚体。

5.碱性α-螺旋：该结构含有高密度的碱性氨基酸，能与DNA结合，但无锌指结构、同源结构和亮氨酸拉链结构。

九、真核生物转录水平的调控机制

真核生物转录水平的调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响起始复合物形成的过程。

1.转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA 复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。

转录起始复合物形成的过程：TFⅡD结合TATA盒→RNA聚合酶Ⅱ识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物→其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放的复合物。

11 分子生物学考试宝典（私房版）

这个过程反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TF ⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。

2.反式作用因子的特点：1）一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域；2）能识别并结合顺式作用元件；3）对基因表达有正性和负性调控作用。

3.转录起始的调控：

1）反式作用因子活性的调节：①表达调节－合成出来就有活性；②共价修饰－磷酸化、去磷酸化、糖基化；③配体结合－许多激素受体是反式作用因子；④蛋白质与蛋白质相互作用－复合物的解离与形成。

2）反式作用因子和顺式作用元件结合发挥调节功能：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守序列，对基因转录起调节作用。

3）反式作用因子作用方式有多种模式：成环、扭曲、滑动等。

4）反式作用因子的组合式调控使调控更精确。

十、真核生物转录后水平的调控机制

1.5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化：是保持mRNA转录过程稳定，不被降解的重要因素。

2. mRNA选择性剪接亦可调控基因表达。

3. mRNA的转运机制调节进入细胞质的mRNA量。

十一、受体的功能、特点和类型

1.功能：特异性结合外源信号分子，并将信号传至细胞内进而产生生物效应。

2.特点：高度特异性、高亲和力、可饱和性、可逆性、放大效应。

3.类型：膜受体和胞内受体。

膜受体主要是传递水溶性信号分子，又可分为：1）离子通道受体：此类受体主要结合神经递质，使离子通道打开或关闭，改变膜的通透性，能迅速、准确低传递神经冲动，但作用时间短；2）G蛋白偶联受体：通过G蛋白影响AC或PLC等改变第二信使浓度，实现跨膜信息传递。分布广泛，主要参与细胞物质代谢的调节和基因转录的调控；3）单次跨膜受体：全为糖蛋白，主要有酪氨酸蛋白激酶受体（胰岛素受体、表皮生长因子受体等）和非酪氨酸蛋白激酶受体（白介素受体、干扰素受体、生长素受体等）。主要与细胞增殖、分裂、分化及癌变有关。

胞内受体多为反式作用因子，主要结合脂溶性信号分子，如：类固醇激素、甲状腺素、维甲酸等。

12 分子生物学考试宝典（私房版）

十二、G蛋白循环

受体与信号分子结合后，受体构象改变，结合G蛋白并使其构象改变，使GTP置换了GDP。G蛋白激活后，离开受体并解离成βγ亚基和α亚基GTP复合物，α亚基通过调节AC、PLCβ等活性，调节细胞内cAMP等第二信使的浓度，从而把信号传导给下游分子。同时，α亚基水解GTP为GDP，然后α亚基GDP复合物重新与βγ亚基结合形成无活性的三聚体，完成一次信息传导。

十三、cAMP信号传导途径

该途径以靶细胞内cAMP浓度改变和激活PKA为主要特征，是激素调节物质代谢的主要途径。信息传递过程为：细胞外信号物质→受体→G蛋白→AC→PKA→酶或功能蛋白质→生物学效应

1）不存在受体激动剂时，G蛋白的3个亚基呈聚合状态，α亚基与GDP结合。

2）存在激活性配体如肾上腺素时，受体与之结合，受体构象改变，暴露出与G蛋白结合的部位，G 蛋白与配体-受体复合物结合，导致G蛋白与GDP结合力下降，释放GDP。

3）在Mg2+存在下，GTP取代GDP使α亚基暴露与AC结合位点，结合并激活AC。

4）AC催化ATP生成cAMP。

5）GTP与α亚基结合几秒后被α亚基的GTP酶活性催化为GDP，α亚基与βγ亚基重新结合，关闭信号使AC失活。

6）cAMP作为第二信使激活PKA，后者进而激活其他靶酶或直接间接激活反式作用因子（CREB），调节基因表达。

当生长激素抑制素等与相应受体结合可结合偶联αi-G蛋白，αi亚基可直接抑制AC活性，同时游离的βγ亚基可与αs亚基结合抑制对AC的活化作用，使AC活性下降。

十四、胰岛素受体途径

胰岛素受体由2个α亚基和2个β亚基组成。配体结合在α亚基部位，β亚基具有内在的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性。

（一）IR介导的IRS-1－Ras－MAPK信号通路

1) 配体与受体的结合导致受体变为二聚体结构，进而导致其发生自身磷酸化，并磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物1)蛋白；

2）IRS-1可结合Grb2蛋白（接头蛋白，含1个SH2结构域和2个SH3结构域），进而结合并

13 分子生物学考试宝典（私房版）

活化调控分子SOS（小分子单体G蛋白调节因子GEF的一种）；

3）SOS促使Ras释放GDP并结合GTP，使Ras激活，然后激活的Ras脱离SOS蛋白。

4）活化的Ras进而活化Raf，Raf是一种MAPKKK,可逐步激活MEK（MAPKK）→ERK1（MAPK），完成MAPK的级联活化；

5）活化的ERK1转位至核内，作用于一些转录调控因子，影响基因的表达。

（二）IR介导的IRS-1－PI3K－PKB途径

PKB是一种与PKA、PKC有很高同源性的蛋白苏/丝氨酸激酶，是原癌基因c-akt产物，能被PDGF、EGF、Insulin等激活。

1) 配体与受体的结合导致受体变为二聚体结构，进而导致其发生自身磷酸化，并磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物1)蛋白；

2）磷酸化的IRS-1通过SH2与PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）的p85亚基结合，激活p110催化亚基；3）PI3K催化PIP2生成PIP3（磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸）；

4）PIP3与蛋白激酶PDK1共同激活PKB；

5）PKB磷酸化目标底物，介导代谢调节、细胞存活等效应。

十五、IP3、DAG在信号传导中的作用（磷脂酰肌醇途径）

1）信号分子与受体结合，引起受体构象变化；

2）受体活化G蛋白（结合GTP，α亚基与βγ亚基解离）；

3）活化的G蛋白激活磷脂酶（PLC）；

4）PLC水解PIP2生成IP3 和DAG；

5）IP3 使钙通道打开，细胞内Ca2+升高；

6）Ca2+与DAG共同激活PKC；

7）Ca2+与CaM结合，激活多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶。

十六、细胞周期的调控

细胞周期的调控主要是多蛋白参与的，针对细胞周期四个主要关卡的调控过程。

1.参与蛋白：1）周期蛋白（cyclin)；2）周期蛋白依赖性激酶（Cdk）；3）Cdk 抑制因子（CKI）；4）Rb蛋白及E2F-DP1转录因子；5）调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶；6）泛素和催化蛋白泛素化的酶。

14 分子生物学考试宝典（私房版）

2.四个关卡：G1晚期的限制点、G1-S转折、G2-M转折、M-G1有丝分裂关卡。

1）G1晚期的限制点：主要监控细胞大小及环境中是否有生长因子，细胞生长到足够大，并且成功完成DNA复制准备工作，才可通过限制点。细胞受到生长因子刺激→在G1中期表达cyclin D，G1晚期期表达cyclin E分别与Cdk4/6 和Cdk2形成复合物→复合物使Rb蛋白磷酸化而释放转录因子E2F 靶基因表达，不再依赖生长因子→通过限制点。（限制点决定细胞的3种命运：①通过限制点继续增殖细胞；②分化并进入G0期，适宜条件可重新激活增殖；③丧失增殖能力，停留在G0期直至死亡。）2）G1-S转折和S期调控：通过限制点的细胞做好DNA复制准备就可通过G1-S转折，开始DNA复制，进入S期。G1-S转折关卡主要监控DNA是否受损。P53可通过促进细胞周期抑制物p21蛋白的表达，阻止受损细胞通过G1-S关卡。或通过促进BAX、EGF-BP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、FAS 等基因转录促进已通过G1-S关卡的受损细胞发生凋亡。进入S期的细胞开始表达cyclin A并结合活化Cdk2，启动DNA复制。

3）G2-M 转折和M期的调控：G2-M 转折关卡主要监控DNA是否受损及DNA是否已经正确完全地复制。

①G1后期开始表达cyclin B，cyclin B与Cdk1结合，在G2-M转折处，Cdk1被磷酸酶Cdc25C 去磷酸化而活化cyclinB-Cdk1,导致底物蛋白（组蛋白1、核纤层蛋白等）的磷酸化，细胞通过G2-M关卡。

②如果细胞DNA受损或复制不完全→激活传感器蛋白并与受损DNA结合→激活ATM和ATR→磷酸化Chk2和Chk1（关卡激酶）→磷酸化Cdc25C→磷酸化的Cdc25C和被14-3-3结合并运出细胞核→Cdk1无法被活化，细胞停滞于G2期。

③细胞进入M期→MPF（促有丝分裂因子，即cyclinB-Cdk1）激活分裂后期促进复合体（APC）→分裂抑制因子泛素化而降解→姐妹染色体分离→APC促进cyclin B降解→细胞核重形成，胞质分裂，产生两个子代细胞。

4）M-G1有丝分裂关卡：该关卡主要监控姐妹染色体是否稳定地附着在纺锤体上。M期的cyclinA/B-Cdk1可使结合在纺锤体处的APC磷酸化而活化，最终导致连接染色体的蛋白质降解。细胞通过关卡进入G1期。

十七、抑癌基因在细胞周期的调控机制与肿瘤发生机制之间的关系

1.RB：RB的作用机制是通过与转录因子E2F-DP1结合，控制细胞无法通过G1-S关卡。RB家族已发

现的3个成员，RB、P107、P130分子中都有个口袋结构能与E2F-DP1结合抑制它的转录活性。在G1中期及晚期，Cyclin D-Cdk4/6和Cyclin E-Cdk2先后磷酸化RB。磷酸化的RB失去活性，

15 分子生物学考试宝典（私房版）

释放E2F-DP1启动靶基因转录，包括：1）Cyclin D、E、A、Cdk2基因；2）某些癌基因；3）E2F基因本身。E2F基因的表达加速RB释放E2F-DP1，也使细胞完成完成DNA的复制准备，细胞通过G1-S 关卡。RB基因表达异常可失去对细胞增殖的控制，诱发肿瘤。

2.P53: p53蛋白是核内的转录因子，其一个重要的靶基因编码p21蛋白。p21蛋白是G1期特异的细胞周期抑制物，作用是阻止细胞通过G1-S关卡。其另一个靶基因GADD45编码DNA修复蛋白，与p21共同作用使受损细胞不再分裂，并修复损伤维持基因组稳定。同时p53还可以促进BAX、EGF-BP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、FAS等基因转录促进已通过G1-S关卡的受损细胞发生凋亡。P53通过上述两种途径使细胞周期停滞，起着稳定基因组和抑制突变细胞产生的作用，从而抑制肿瘤的发生。

十八、细胞凋亡的基因调控

1.死亡受体途径（外源性）：哺乳动物细胞表面至少有8种死亡受体：Fas、TNFR1、TNFR 2、DcR1、DcR 2、DR3、DR4 、DR5。它们都属于TNFα家族成员。

以Fas为例：Fas结合Fas L→Fas形成三聚体，激活死亡结构域（DD）→募集接头蛋白FADD（也含有DD）→Fas-FasL-FADD形成死亡诱导信号复合物（DISC），FADD的死亡效应域（DED）被激活→通过DED 募集caspase 8前体→caspase 8自我激活→激活caspase 3→细胞凋亡

2.线粒体途径(内源性）：通常在生长因子缺乏、生长环境不适、化学物质或射线导致DNA损伤后发生，细胞色素C进入胞浆是关键步骤，需要调节蛋白Bcl2家族参与。

（线粒体释放细胞色素C的3种模式：①Bax和Bak在线粒体外膜上打孔；②通过线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道（VDAC）；③它们使线粒体外膜上天然存在的ATP-ADP转运蛋白孔道保持开放，使细胞色素C从线粒体外膜间隙进入胞浆）

进入胞浆的细胞色素C与Apaf 1、ATP/dATP结合形成凋亡体→Apaf 1通过胱天蛋白酶募集域（CARD）与caspase 9前体的CARD作用募集caspase 9前体→富集的caspase 9自我激活→激活caspase 3 →细胞凋亡。

3.凋亡有正负调节和两条凋亡途径的串话

1）正调节：caspase 8、caspase 9前体的自我激活和caspase的级联酶促放大效应。

2）负调节：①FLIP抑制caspase 8前体的活化；②Bcl-2家族中抗凋亡成员阻断促凋亡成员；③胞浆中存在的能抑制caspase的凋亡抑制物（IAP）。

3）两条途径串话：caspase8不仅能活化下游caspase，还能切割促凋亡因子Bid，使其活化并结合到线粒体，促进Bax或Bak的活化，进而促进细胞色素C的释放，活化内源凋亡途径。

16 分子生物学考试宝典（私房版）

十九、DNA聚合酶的作用

1.DNA聚合酶Ⅰ(全酶)：具有5’→3’聚合酶活性、5’→3’外切酶活性、3’→5’外切酶活性（校正活性）。

主要应用：1）催化DNA缺口平移反应；2）对双链DNA 3’突出末端进行末端标记;3)第二cDNA链合成;4)Sanger 测序

2.klenow聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性、3’→5’外切酶活性缺失5’→3’外切酶活性。

主要应用：1）对双链DNA 3’突出末端进行末端标记；2）第二cDNA链合成；3）Sanger 测序；4）随机引物法标记法

3.Taq DNA聚合酶：具有DNA依赖的5’→3’聚合酶活性、5’→3’外切酶活性、末端脱氧核苷酸转移酶活性（3’加尾）、逆转录酶活性。

主要应用：1）PCR反应扩增基因；2）平末端加A尾，用于T-A克隆

二十、大肠杆菌表达系统中外源基因表达的条件及影响因素（条件优化）

1.表达条件

1）应选用大肠杆菌表达载体。该载体应具有：①有自己的复制子；②有多克隆位点；③具有可供选择的遗传标记；④有足够的容量；⑤可通过特定的方法导入宿主菌；⑥配备与大肠杆菌相适宜的完整表达盒，可诱导启动子、转录子、SD序列等。

2）来自真核细胞的目的基因要适当改造。目的基因必需是cDNA，起始密码子(ATG)上游的非编码序列或信号肽序列应去除。

3）目的基因与载体可以按不同方式连接。目的基因连接在起始密码后可用于表达非融合蛋白。表达融合蛋白时可将目的基因连接于原核基因编码序列。

（融合蛋白的优点：①稳定，不易被细菌蛋白酶水解；②可产生分泌型产物；③可利用针对融合蛋白原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化；④原核蛋白部分可用蛋白酶切除，释放真核蛋白）4）选择适当的受体菌株和诱导条件：根据启动子类型和特定蛋白质选择表达效率高的菌株。

2.影响因素

1）选择可调控的强启动子；

2）引入原核增强子样序列；

3）设计合理的SD序列并调整SD序列与ATG之间的距离，增强核糖体和mRNA的结合程度；

4）使用大肠杆菌优势密码子或共表达稀有密码子的tRNA基因；

17 分子生物学考试宝典（私房版）

5）增加mRNA的稳定性，5’端加入“发夹”结构，3’端加入重复性基因外回文序列（REP）；

6）提高表达产物的稳定性：①分泌表达；②与细菌固有蛋白融合表达；③改造蛋白酶识别位点；④使用蛋白酶基因缺陷细菌；⑤共表达蛋白稳定辅助因子（HSP、分子伴侣基因等）

二十一、良好载体的条件

1.带有复制子（DNA聚合酶识别位点），能在宿主细胞内携带外源基因一同复制；

2.载体必须带有多克隆位点（MCS），以供外源DNA插入；

3.载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性和阴性重组子；

4.载体分子必须有足够的容量；

5.可通过特定的方法导入宿主；

6.对于表达载体要有与宿主细胞相适应的能使外源基因表达的完整表达盒。（如：启动子、增强子、加尾信号，终止信号，SD序列等）

二十二、逆转录病毒的优缺点

1.优点：1）高效地感染分裂的宿主细胞（100％）；2）在感染后，能将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；3）利用重组逆转录病毒能将目的基因传递给整个细胞群；4）宿主范围广，可以感染多种人和宿主细胞；5）不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。

2.缺点：1）只能整合到分裂相的细胞；2）容量小（不超过10kb）；3）病毒滴度不高；4）随机整合，有激活癌基因的潜在危险。

二十三、腺相关病毒载体特性及其应用前景

腺相关病毒是一类单链线状DNA缺陷型病毒。

1.优点：1）是非病原微生物,未发现野生型AAV与人类疾病有关;2）宿主范围广，它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞；3）携带的外源基因可长期存在,稳定表达，且受周围基因调控；4）可定点整合在人19号染色体上，插入突变的危险性相当低。

2.缺点：1）只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；2）整合时需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；3）很难大量生产；4）感染效率较逆转录病毒低；5）40％～80％成人人感染过该病毒，可能会引起免疫排斥。

3.应用前景：AAV载体在多种组织都进行了成功的转染,如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和气

18 分子生物学考试宝典（私房版）

道上皮等组织未发现对机体有致病性。

AAV载体能转染非分裂期细胞和持久表达转基因产物的特点,适用于人造血干细胞基因转染，用于治

疗血液系统疾病。另外在治疗帕金森氏综合症,杜氏肌营养不良,肺囊状纤维化等疾病方面也有良好的应用前景。

二十四、基因功能分析的三大策略

特定基因功能研究的基本策略：通过特定基因的导入和特定基因的剔除或表达的抑制，制备模式生物体或体外培养的细胞模型，观察和检测其表型（包括整体、细胞、分子水平）的变化，从而分析、鉴定特定基因的功能。

基因功能研究的工具包括动物模型和模式生物。如转基因动物、基因转染细胞等。

采用的技术有基因转移、基因敲除、RNA干扰等技术。

1. 转基因模型的应用

1）利用转基因动物分析特定基因功能：①确定特定基因的功能；②发现新的基因功能或未知基因的功能；③发现新基因（突变）；④研究基因表达的时空性；⑤建立外源基因表达、调控的动物模型；

⑥产生需要的器官或组织；⑦用于只在胚胎期表达的基因结构和功能的研究。

2）利用转染细胞模型研究特定基因：通过将目的基因转移入细胞中，建立细胞模型，以研究目的基因的功能。也可将转染的细胞植入生物体内，研究基因的功能。

2. 基因敲除模型的应用

基因敲除（gene knockout）是目前在体内研究基因功能的最佳方法，指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程。①可用于观察特定基因在整体上的功能是否唯一，或可被其他基因替代；②一些胚胎发育期的重要基因多采用条件性基因敲除模型进行研究；③可用于推断基因在疾病发生发展中的作用

3. 基因表达的抑制或沉默

基因表达的抑制或沉默是通过在RNA水平的干涉来分析特定基因功能的方法。

1）反义RNA抑制基因表达：反义RNA是能与mRNA互补配对的RNA分子，可通过与mRNA结合而阻碍蛋白质合成；

2）RNA干涉是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。原理：双链RNA 激活Dicer（酶复合物，由核酸内切酶和解旋酶组成），识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp），siRNA与Dicer结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），

19 分子生物学考试宝典（私房版）

双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。

二十五、转基因动物构建外源基因载体的要求和导入方法

1.转基因载体要求：1）外源基因能够表达；2）常需要报告基因；3）根据需要，可选用组织特异性启动子、可诱导型启动子等；4）导入前应将其线性化；5）纯度要高。

2.导入方法：1）显微注射法；2）逆转录病毒感染；3）精子载体法

二十六、基因诊断常用的技术

1.聚合酶链反应(PCR)

2.核酸分子杂交技术

3.DNA序列测定

4.DNA芯片分析

5.限制性内切酶酶谱分析（RFLP）

6.单链构象多态性检测(SSCP)

二十七、基因诊断的特点

1.特异性强：因为基因突变和外源致病基因存在是疾病最原始本质的因素，所有基因诊断的特异性可高达100％；

2.灵敏度高：检测灵敏度达pg水平，样品使用量少；

3.取样方便，稳定性好：任一有核细胞均可作为检测样本，如：血液、精子、唾液、尿液、毛发、牙齿等。且基因化学本质是核酸，较蛋白质样本稳定，可长期保存，对原始样本要求不高，污染的

也可检测；

4.是一种快速、早期的诊断技术：只需几个小时就可作出诊断，在疾病未表现症状的情况下便可进行准确的早期诊断；

5.应用广泛：1）在基因水平对疾病的早期诊断；2）对家族性遗传病进行预警诊断；3）对有遗传病家族史并携带致病基因或疾病相关基因的胎儿做产前诊断；4）确定与疾病有关联的状态，如对疾病易感性、发病类型、发展阶段、是否具有抗药等进行分析；5）诊断体外不易培养的病原体（HIV、HBV）并进行基因分型。

20 分子生物学考试宝典（私房版）

二十八、基因诊断的策略

1.致病基因已知，发病机制已知→直接检测致病基因；

2.致病基因未知，发病机制未明，但致病基因已定位于染色体或基因组特定区域→检测致病基因的连锁遗传标记；

3.多因素、多基因病（高血压、肿瘤等）→检测表型克隆：对疾病相关一组基因克隆制作探针进行诊断，不受基因作用及相互作用方式影响。

4.基因结构无变异，但表达发生改变→定量分析。

二十九、基因治疗的策略

1.基因置换：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。

2.基因增补：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

3.基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

4.导入自杀基因：将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。

5.基因修饰－－改变细胞功能：如基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法、基因修饰TIL的过继免疫方法、免疫增强基因疗法、原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法。

6.基因标记：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。

三十、基因置换或基因添加的必要条件

1.对导入的基因及其产物有详尽的了解；

2.外来基因能有效地导入靶细胞；

3.导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；

4.导入基因能有适度水平的表达；

5.基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害；

三十一、转基因靶细胞的选择

1.选择目的基因表达的组织细胞最好是组织特异性细胞；

2.细胞较易获得，且生命周期较长；

21 分子生物学考试宝典（私房版）

3.离体细胞较易受外源遗传物质转化；

4.离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活；

5.目前常用的靶细胞：造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。

三十二、理想的基因治疗载体具备的性质

1.易于进入靶细胞；

2.在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达；

3.外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件；

4.整个过程应安全有效并具有选择性；

5.易于大量生产。

三十三、哪些疾病可用基因治疗

1.遗传病的基因治疗

1）在DNA水平明确其发病原因及机制；

2）必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；

3）该基因的表达不需要精确调控；

4）该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用；

5）该遗传病不经治疗将有严重后果。

2.肿瘤基因治疗

1）通过基因置换和基因增补，导入多种抑癌基因抑制癌症的发生、发展和转移；

2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；

3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥作用；

4）导入“自杀基因”杀伤癌细胞；

5）提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏、耐药基因的相关治疗

6）联合基因治疗：自杀基因、免疫因子基因、抑癌基因、自杀基因与细胞因子基因、抑癌基因与免疫因子基因。

（常用方法：①基因干预技术：反义RNA、RNA干扰、反义基因；②自杀基因治疗；③免疫基因治疗：细胞因子基因治疗、MHC基因治疗；④提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏、耐药基

22 分子生物学考试宝典（私房版）

因的相关治疗；⑤联合基因治疗：自杀基因、免疫因子基因、抑癌基因、自杀基因与细胞因子基因、抑癌基因与免疫因子基因。）

3. 病毒性疾病的基因治疗

1）诱导对病毒RNA的降解；

2）抑制病毒与宿主细胞的结合；

3）干扰病毒基因组的转录起始和调控；

4）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成；

5）RNA干扰技术。

三十四、PCR原理及影响因素

原理：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内的DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热的DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环反复进行，就可以使目的DNA得以迅速扩增。

影响因素：

1. 引物设计：

①引物长度：一般为15-30bp，常用20bp左右。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应的退火温度，使延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃），影响产物的生成。

②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带；碱基最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3个连续的G 或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸

④避免引物内部出现二级结构和引物间互补，特别避免3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产

生非特异性的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物5′端可修饰,引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；

23 分子生物学考试宝典（私房版）

引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

⑧引物量：每条引物的浓度0.1～0.5umol或10～100 pmol以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

2. 酶及其浓度：不同酶活性、保真性、热稳定性和可扩增的片段长度不同。一个典型的PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3. Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP 浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

4. dNTP 的质量与浓度：工作浓度为20～200umol/L，浓度过高可增加反应速度，也增加错配率和实验成本，同时也可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。降低浓度可导致反应速度减慢，可提高反应的特异性，但过低会影响PCR产量。4种dNTP要等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

5. 模板DNA的浓度：0.1～2ug/100ul体系.PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高，模板DNA 浓度过高导致非特异性产物增加。

6. 退火温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素，退火温度可按Tm－（5～10℃）估算。退火时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。

7.反应循环数：循环次数决定PCR扩增程度，取决于模板DNA的浓度

循环次数一般在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

三十五、Sanger法原理

DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。应用高分辨的聚丙烯酰胺电泳，结合高效放射自显影技术便可直接读出DNA序列。

24 分子生物学考试宝典（私房版）

三十六、Westen blot法原理

首先将混合的的蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按大小分开，再通过电转移将蛋白质转移到NC膜或其他膜上。分析时先通过特异性的一抗与转移膜上的蛋白质结合，再用酶标记（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）或放射性核素标记的二抗与之结合，反应后用底物显色或放射自显影检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。

三十七、核酸分子杂交的原理

具有一定同源性的两条核酸单链（DNA/RNA）在适宜条件下（温度及离子强度）可以按碱基互补配对原则退火形成双链分子，由此可以检测核酸分子存在与否。这一过程实质上是核酸分子变性、复性过程，是高度特异的过程。

三十八、核酸分子杂交的影响因素

1.核酸分子浓度和长度：浓度高，复性快，长度50～300碱基为宜；

2.温度：过高不利复性，过低局部双链不易解离，适宜温度为Tm-25℃左右；

3.离子强度：杂交率随离子强度增加而增加，不完全同源核酸分子杂交时可以选择高盐，高度同源核酸序列杂交可以在高温、低盐条件下进行。

4.杂交液中的甲酰胺：能降低核酸杂交的Tm值，使低温条件下探针结合更稳定；

5.核酸分子复杂性：指反应体系中不同序列的总长度，复杂性越高，杂交越容易；

6.非特异性杂交反应：杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭。

三十九、核酸探针标记的方法

1.切口平移法：利用适当浓度DNaseⅠ在DNA双链上随机切割单链，形成单链缺口。利用DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性，在切口处将旧链切除，同时用标记的dNTP按碱基互补配对原则合成新链，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸取代。

2.随机引物法：常用的随机引物是六核苷酸片段混合物，这些分子在每个位置上都有可能有含有所有4种碱基的组合，因此可以与任意核苷酸序列互补，作为DNA扩增的引物。将变性DNA分子与这些随机引物杂交后，在一种标记dNTP和3种未标记dNTPs存在下，由klenow聚合酶合成带有标记的DNA探针。

25 分子生物学考试宝典（私房版）

3.RNA探针的标记：在带有RNA聚合酶识别的启动子的人工载体的启动子下游插入目的基因，再在插入序列下游切口质粒使其线性化，在一种标记NTP和3种未标记NTPs存在下，特异RNA聚合酶可将目的基因的DNA转录成互补的RNA探针。

4.DNA探针的末端标记：利用T4 DNA聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶等在DNA末端进行部分标记。

5.cDNA探针标记：在反转录酶合成cDNA反应中，加入标记核苷酸合成cDNA探针，可选用特异的寡核苷酸引物、随机引物或oligo dT引物。

6.寡核苷酸探针标记：在合成过程中直接加入标记的核酸制成探针，也可以合成后再用末端标记法标记。

7.PCR标记法：在PCR反应体系中将一种dNTP换成标记的dNTP，合成特异的DNA探针。

四十、探针的种类和优缺点

1.cDNA探针：是目前应用最广泛的探针，通过逆转录获得cDNA再克隆到适当载体，扩增、纯化后获得。

优点：无内含子和重复序列。缺点：获得复杂，含polg dT可产生非特异性杂交。

2.基因组探针：从基因组文库筛选得到特定基因或基因片段的克隆后扩增、纯化，切取插入片段后分离纯化为探针。

优点：获得方便，纯度高。缺点：探针可能存在高度重复序列，引起假阳性。

3.寡核苷酸探针：根据已知核酸序列，直接合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。

优点：可根据需要合成相应序列；片段长度短，受Tm影响大，特别适合基因突变分析；序列复杂性低，杂交时间短。缺点：所带标记物少，非放射标记时敏感度低。

4.RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可得到RNA或反义RNA探针。

优点：杂交体稳定性高，杂交条件严格，特异性更高；不存在互补双链结合，杂交效率高；不存在高度重复序列；杂交后可用RNase将未杂交探针消化，本底背景低。缺点：含ployA尾；易降解不易操作；来源极不方便。

四十一、反义RNA用于基因治疗必须解决两个关键问题，及如何解决？

1.专一性转移问题：反义RNA进行治疗时必须针对病变的特殊组织、器官或系统特殊细胞，对其他正常细胞影响越小越好，这就必须解决专一性问题。

2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题：反义RNA抗RNase的能力不强，注射到体内容易被降

26 分子生物学考试宝典（私房版）

解，残余的少量反义RNA分布全身，无法得到很好的调节效果。

3.解决方法：1）利用特定受体介导反义RNA转移。由于受体配体结合的特异性，将特定配体改造为转运反义RNA的工具，可高效、专一的转移反义RNA。同时由于被转移反义RNA是被保护的，可抵

抗核酸酶的降解作用，提高转移效率。2）对反义RNA进行些修饰，如用硫代磷酸核苷替代通常的核苷酸可以提高抗降解的能力；3）设计可调控表达反义RNA片段的质粒。

四十二、RNAi的机制及主要技术过程

RNA干涉是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。

机制：双链RNA 激活Dicer（酶复合物，由核酸内切酶和解旋酶组成），识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp），siRNA与Dicer结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。

RNAi技术的主要过程：

1.确定目标RNA 并选择被干涉靶点：1）避开蛋白结合部位，选择AUG下游50-100bp区的AA（N19）TT或AA（N21）序列；2）GC比50%左右，长30nt；3）与其它RNA序列无同源性；

2.准备针对目标RNA的siRNA：1）化学合成法（价格较高）；2）体外转录法（操作难度大）；3）体内转录法（简单易行，效果稳定）；

3.用siRNA干涉目标RNA;

4.目标RNA含量和蛋白质水平的分析。

四十三、蓝白筛选的原理

某些质粒载体（如pUC系列）带有大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）前一部分片段，在lacZ基因区又另外插入了一段含多克隆位点的DNA序列。这些位点上如果没有插入外源DNA片段，在质粒被导入携带lacZ基因C端编码区的大肠杆菌后，质粒携带的lacZ基因片段（N端）将正常表达，与大肠杆菌的lacZ基因产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，使X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色菌落。如果多克隆位点有外源DNA片段插入，将使lacZ 基因灭活，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈白色。可用于筛选重组克隆和非重组克隆，称为篮白筛选。

27 分子生物学考试宝典（私房版）

补充

名词解释：基因型、表现型、基因文库、GT-AG法则、质粒、SNP、母系遗传、不对称转录、分子伴侣、信号肽、同裂酶、同尾酶、限制性核酸内切酶

问答题：基因芯片的基本原理、蛋白质芯片的概念和原理、原核生物转录翻译的调控、真核生物翻译水平的调控机制、外源基因导入真核细胞的方法、转基因动物的原理和步骤、酵母双杂交的原理（06研考）、酵母双杂交系统的优点及应用

28