肿瘤坏死因子(一)
肿瘤坏死因子(一)
作者：孙嗣国，马保安，周勇，范清宇
【关键词】,肿瘤坏死因子Osteoclastformationandboneresorptioninducedbytumornecrosisfactorα
【Abstract】AIM:Toinvestigatewhethertumornecrosisfactorα(TNFα)caninduceosteoclastformationfromperiph eralbloodmononuclearcells(PBMCs)independentofreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand( RANKL).METHODS:PBMCswereculturedinthepresenceofmacrophagecolonystimulatingfactor （MCSF）andTNFαinvitro.RANKLblockingagentRANK:FcandneutralizingantiTNFαantibodywererespectivelya ddedtotheculture.Attheendoftheculture,PBMCsculturedoncoverslipswerefixedandstainedfortartr ateresistantacidphosphatase(TRAP),https://www.360docs.net/doc/ba651975.html,cunaresorptionondentineslices,afunct ionalmarkerofosteoclast,wasalsoobservedusingscanningelectronmicroscopyandlightmicroscopy.R ESULTS:TNFαinducedtheformationofmultinucleatedcells(MNCs)whichwereTRAPpositiveandshow edevidenceoflacunaresorptionpitformationondentineslices.RANK:Fcdidnotinhibitthisprocesswhil eneutralizingantiTNFαantibodycompletelyblockedboththeformationofMNCsandlacunaresorption. CONCLUSION:InthepresenceofMCSF,TNFαcandirectlyinducemononuclearphagocyteosteoclastpre cursorstodifferentiateintoosteoclasticcellscapableoflacunaresorption.
【Keywords】TNFα;osteoclast;boneresorption
【摘要】目的：验证肿瘤坏死因子α（TNFα）是否可以直接诱外周血单核细胞（PBMCs）分化为具有骨吸收作用的破骨细胞.方法：小白鼠PBMCs体外培养中加入TNFα和白细胞介素1α（IL1α）及巨噬细胞克隆集落刺激因子（MCSF）；同时，分别加入细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的拮抗剂RANK:Fc和抗TNFα中和抗体.对培养终末细胞作组织化学染色，检测破骨细胞特征性标志物抗酒石酸磷酸酶（TRAP）的表达；并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成为指标检测其生物学活性.结果：PBMCs体外培养形成大量TRAP阳性的多核细胞（MNCs）；象牙磨片上见到虫蚀样骨吸收陷窝，后者的面积对TNFα呈剂量依赖性.RANK:Fc 对此现象无抑制作用，而抗TNFα中和抗体可完全阻断该现象的发生.结论：TNFα能够直接诱导PBMCs分化为具有骨吸收功能的破骨细胞.
【关键词】肿瘤坏死因子α；破骨细胞；骨吸收
0引言
破骨细胞是由单核巨噬系统的破骨细胞前体细胞分化而来的多核细胞(MNCs).多种炎性及非炎性的骨与关节的病变，如骨质疏松、风湿性关节炎、无菌性松动等都与破骨细胞代谢异常有关.近年来的研究表明肿瘤坏死因子(TNFα)通过多种方式参与破骨细胞的分化及生物学活性的调控〔1,2〕.在本实验中，我们将小白鼠外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)及RAW246.7细胞体外培养，并加入TNFα及其他因子，验证TNFα是否可以直接诱导破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂αMEM中加入100u/mL青霉素，10mg/L链霉素和10mmolL谷氨酸及100mL/L胎牛血清(Invitrogen,UK)配制成完全培养基(MEM/FBS)；重组人巨噬细胞克隆刺激因子（MCSF）、鼠可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体(solvablereceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand,sRANKL)、RANKL拮抗剂（RANK:Fc），TNFα，IL1α，抗TNFα中和抗体均购于R&DSystems公司（UK），抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于Sigma公司（UK）.
1.1.2动物及细胞系6~9wk的BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心提供).RAW264.7细胞系由MikeRogers博士(Aberdeen,UK)惠赠.
1.1.3象牙骨片的制备将象牙磨至65μm厚,再冲压成直径4mm的圆形骨片,超声波处理,消毒备用.
1.2方法
1.2.1小白鼠PBMCs的分离、培养及试验分组将小白鼠外周血按1∶4稀释于MEM后缓慢加到histopaque(Sigma,UK)表面,离心(693g)30min.吸取处于界面层的细胞，重悬于MEM并离心（600g）10min，重复两次，然后重悬于MEM/FCS.50mL/L醋酸溶解红细胞后，细胞记数板记数PBMCs.事先将灭菌的4mm直径的象牙磨片和直径6mm的玻璃盖玻片分别放入96孔细胞培养板.将2×105PBMCs加入放有象牙磨片或盖玻片的96孔细胞培养板，调整培养液(MEM/FBS)至总体积0.1mL；孵育2h后将象牙磨片及玻璃盖玻片取出，并在MEM/FCS中充分涮洗以去除非黏附细胞，然后转移到24孔组织培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1mL.每3日更换培养液及各种因子.
实验分组：A组加入25μg/LMCSF和10μg/LIL1α作为阴性对照；B组加入25μg/LMCSF和30μg/LsRANKL作为阳性对照；C组加入25μg/LMCSF，10μg/LIL1α和不同浓度的TNFα；D组E组加入25μg/LMCSF，10μg/LIL1α和25μg/LTNFα，分别再加入100μg/L的抗TNFα中和抗体和RANK:Fc.
1.2.2RAW246.7细胞的培养及实验分组5×103RAW246.7细胞加入含有0.5mLMEM/FCS及2块玻璃盖玻片或3块象牙磨片的24孔细胞培养板中，调整培养液至总体积为1mL.孵育2h后将盖玻片和象牙磨片取出并在MEM/FCS中充分涮洗，去除非黏附细胞后放入新的24孔细胞培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1mL,每2日更换培养液及各种因子.实验分组：A组加入25μg/LTNFα和10μg/LIL1α;B组加入10μg/LIL1α作为阴性对照；C组加入30μg/LsRANKL作为阳性对照.
1.2.3破骨细胞的鉴定于孵育24h中止部分象牙磨片和玻璃盖玻片上的细胞培养并鉴定,以排除PBMCs中含有成熟OC的可能.再于9d，14d分别终止玻璃盖玻片和象牙磨片上的PBMCs 细胞培养.于培养的第5日和第8日分别终止玻璃盖玻片和象牙磨片上的RAW246.7细胞培养.玻璃盖玻片用于TRAP染色，象牙磨片用于检测骨吸收陷窝的形成.
TRAP染色：玻璃盖玻片于空气中晾干并用柠檬酸/丙酮固定细胞，按照试剂盒说明书作组织化学染色检测破骨细胞标志物TRAP的表达.
甲苯胺蓝染色及电镜扫描(SEM)：象牙磨片浸泡于NH4OH(1mol/L)30min、超声波处理去除黏附的细胞及碎片后，蒸馏水润洗并于空气中晾干.甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下检测虫蚀样骨吸收陷窝的形成，并计算虫蚀样骨吸收陷窝面积占象牙磨片总体面积的百分比.另外有一部分象牙磨片用梯度乙醇脱水、空气晾干并覆以金粉涂层后做电镜（PhilipsSEM505）扫描. 统计学处理：每次实验中各组分别设3个象牙磨片，实验一共重复3次.应用SPSS10.0软件包处理数据.计量资料以x±s表示.在比较C组与E组的骨吸收陷窝面积差异时采用Studentst 检验，P0.05时认为差异具有显著性.
2结果
2.1TNFα诱导PBMCs形成具有骨吸收活性的MNCs24h后终止细胞培养未见TRAP阳性MNCs 或虫蚀样骨吸收陷窝形成.培养终止后，仅有MCSF和IL1α存在的条件下（A组），未见TRAP 阳性细胞或虫蚀样骨吸收陷窝形成.而加入sRANKL后（B组）有大量TRAP阳性MNCs(Fig1A)和虫蚀样骨吸收陷窝形成(Fig2A，B).在MCSF和IL1α存在的条件下，TNFα（C组）诱导PBMCs 形成数量不等的TRAP阳性的MNCs（Fig1B），相应的象牙磨片上出现数量、大小不等的虫蚀样骨吸收陷窝（Fig2C，D），并且虫蚀样骨吸收陷窝的面积随TNFα剂量的增加而增大（Fig3）.同sRANKL(B组)相比较TNFα(C组)诱导的TRAP阳性MNCs的直径小且所含细胞核数量少，
视野内见大量TRAP阳性的单核细胞（Fig1B）；并且所形成的虫蚀样骨吸收陷窝亦较后者小而浅（Fig2C，D）.
2017年肿瘤坏死因子TNF-α分析报告
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正文目录 一、单克隆抗体：生物药领域最大的子行业，2016年全球市场900亿美金4 1)单克隆抗体：生物药领域最大的子行业，占据生物药市场的43% (4) 2)肿瘤坏死因子-α（TNF-α）：细胞信号通路中重要一环，药物研发的热门靶点 (5) 二、五大TNF抑制剂的结构、适应症、价格等的比较分析 (6) 1)TNF抑制剂的结构比较：四个单克隆抗体，一个融合蛋白 (6) 2)TNF抑制剂的销量比较：修美乐连续五年位居全球药品销量冠军 (7) 3)TNF抑制剂的适应症比较：修美乐和恩利获批的适应症较多 (10) 4)生物仿制药陆续获批，修美乐、类克和恩利面临冲击 (11) 三、我国单抗行业起步较晚，TNF抑制剂潜在市场规模约125亿元 (12) 1)我国单抗药物市场规模约70亿元，在生物制药领域占比较低 (12) 2)我国TNF抑制剂市场：三家国企+三家进口 (12) 3)我国TNF抑制剂市场约15亿元，潜在市场规模125亿元 (14) 四、相关建议 (15) 五、风险提示 (15) 图目录 图1：全球生物药市场 (4) 图2：临床研发和上市的生物药靶点 (5) 图3：TNF信号通路 (6) 图4：五大TNF抑制剂的结构比较 (7) 图5：修美乐的全球销量（单位：亿美金） (8) 图6：恩利的全球销量（单位：亿美金） (8) 图7：类克的全球销量（单位：亿美金） (9)
图8：Cimzia的全球销量（单位：亿美金） (9) 图9：Simponi的全球销量（单位：亿美金） (10) 图10：中国生物药品市场规模（单位：亿元） (12) 图11：样本医院TNF抑制剂的销量占比 (13) 表目录 表1：2016年全球药品销售前十名 (7) 表2：五大TNF抑制剂的适应症和价格比较 (10) 表3：TNF抑制剂的生物类似物 (12) 表4：在申报的进口TNF抑制剂 (13) 表5：我国上市的TNF抑制剂规格和费用 (14) 表6：部分在申报的以TNF为靶点的生物药 (14)
肿瘤坏死因子α
肿瘤坏死因子 摘要恶性肿瘤疾病目前仍是全世界需要共同面对的一个医学难题，其发病隐匿，早期容易被忽视，而临床患者多数已到中晚期，此时的疾病已很难治疗。肿瘤坏死因子是一种能使肿瘤出血，并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞的蛋白类物质，1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第一个用于肿瘤生物疗法的细胞因子，但因其缺少靶向性且有严重的副作用，对该基因的研究和应用形成了很大的障碍，目前很多研究人员正致力于该基因改造与应用。 关键词TNF、肿瘤 1TNF的生物学特征 TNF按其结构可以分为两种：TNFα和TNFβ。TNFα是一种单核因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，TNFβ是一种淋巴因子，由活化的T细胞和NK细胞产生，目前研究多为TNFα。 人的TNFα位于第6号染色体短臂上，与MHC紧密连锁[1]，人的TNFα基因大小为2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。TNFα的蛋白质结构有多种形成，有二聚体、三聚体、五聚体，其中有生物活性的是三聚体。TNFβ位于TNF α的5’端，同样由4个外显子和3个内含子构成，其中第4个外显子与TNFα高度同源，编码80%-90%的成熟蛋白质。 2 TNFα的来源与表达 TNFα在人体内的来源途径有很多，如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等都可以在一定的条件下产生和释放TNFα。目前认为TNFα主要的生物合成场所有心、肝、肺、肾[2]。各种外来刺激如内毒素脂多糖(LPS)、肠毒素、霉菌抗原、某些寄生虫的溶解物、病毒颗粒等，均可以引起TNFα的表达与释放。 在正常情况下，TNFα只由心肌间质的巨噬细胞产生，在某些病理状态下，如感染或内毒素的刺激下，心脏可以产生TNFα，Giroir[3]等研究证实这一点，在这些应激状态下，成熟的心肌细胞同样可以产生TNFαmRNA及其蛋白质，且产生的量同巨噬细胞产生的差不多。 Kleine等[4]证实，在生理状态下，脑内在结构和功能方面与巨噬细胞相似的细胞如神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞均可合成分泌TNF、IL-6等细胞因子。在炎症情况下，这些细胞因子的水平明显升高，且对中性粒细胞有明显趋化作用[5]。有研究表明，有大约20%的恶性肿瘤的发生与慢性炎症有关[6]。 3 TNFα受体 通过对TNFα分子一级结构的研究表明，C-末端在TNFα的生物学活性中起决定性作用。由于C-末端参与TNFα高级结构的构成，只要切掉1个氨基酸就可使TNFα丧失生物学活性。而N-末端的变化范围较大，适当改变其长度并不影响其生物学活性，N-末端还与TNFα对受体的结合能力密切相关，可能为与受体结合的部位。 TNFα生物学效应的发挥，有赖于其与靶细胞上的TNFR相结合，并通过受
肿瘤坏死因子与肿瘤的研究进展
肿瘤坏死因子与肿瘤的研究进展 发表时间：2018-02-09T09:45:50.713Z 来源：《医师在线》2017年11月下第22期作者：张林王哲 [导读] TNF-α表达水平的增高预示着炎症反应的发生以及进一步加重，并提示有癌变倾向，对诊断早期病变有指导性价值。 （毓璜顶医院检验科；山东烟台264000） 摘要：肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种由单核一巨噬细胞系统分泌产生的多功能细胞因子, 具有调节机体的免疫功能和导致肿瘤细胞坏死的特性。近年来， TNF-α在抗肿瘤中的作用引起国内外学者的高度关注。本文通过对TNF-α与肿瘤的研究做一综述，为生物学和医学提供参考依据。 【关键词】肿瘤坏死因子；肿瘤坏死因子受体；肿瘤；关系 1. TNF-α的分子结构 人的TNF-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，分别定位于第6对和第17对染色体短臂上。 2. TNF-α的分布 TNF-α来源非常广泛，如单核-巨噬细胞系统、淋巴细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。TNF-α在体内以两种形式存在：可溶性的TNF-α（sTNF-α）和膜相关的TNF-α（mTNF-α）。 3. TNF-α的生物学活性 TNF-α是一种多功能的细胞因子，具有广泛的生物学特性。TNF-α不仅对肿瘤细胞具有细胞毒性和生长抑制作用；同时在机体的细胞功能调节、免疫和炎症反应等过程中起重要作用[1]。 4. TNF-α与肿瘤 TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。它在体内、体外均对肿瘤细胞有明显的细胞毒性，能特异性杀伤或抑制肿瘤细胞，而对正常细胞无毒性作用[2]。近年来，越来越多的国内外学者开始研究肿瘤的发生机制，期望能够找到癌症作用过程的关键靶点，从而实现肿瘤的预防及治疗。 4.1 TNF-α与皮肤癌 目前，许多致癌化合物被广泛应用于建立各个靶器官的肿瘤模型，进而研究人类肿瘤发生发展过程中的关键分子机制。Masami Suganuma等学者建立了小鼠皮肤癌的模型。同时Marques CM等学者对TNF-α在皮肤黑色素瘤发生发展中的影响进行了研究[3]。他们的研究表明， TNF-α在小鼠皮肤癌的发生发展过程中起到非常关键的作用，提示TNF-α很可能在人类癌症发生过程中也起到相同的作用。 4.2 TNF-α与乳腺癌 乳腺癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤，近年来在我国发病率呈上升趋势。有研究表明，高剂量的TNF-α处理引起肿瘤中血管退行性改变和出血性坏死，表明TNF-α可以作为抗癌物质应用。但是，也有研究表明，在体内，肿瘤细胞中内源性TNF-α的分泌并不杀伤肿瘤，反而通过诱导恶性乳腺上皮细胞等肿瘤细胞增殖，并促进血管再生、肿瘤细胞侵袭和转移等引起肿瘤发生发展[4]。因此，到目前为止TNF-α并未广泛用于乳腺癌治疗。随着对TNF-α研究的深入，对其在乳腺癌中发挥作用的了解更加清楚，可能有助于提高临床监测乳腺癌进展的水平，为治疗乳腺癌提供新的靶点。 4.3 TNF-α与肝癌 据流行病学调查显示，近年来肝癌的发病率急剧增高，尤其在患有非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化的肥胖病人中更为突出。越来越多的研究表明，肝癌和炎症之间存在密切联系，许多分子机制被提出，它们对肝癌发展起到重要作用，包括最近报导的淋巴毒素信号肽。最近，Park等[5]证实IL6和TNF-α具有促肿瘤作用。TNF-α还能诱导依赖NF-κB基因编码的抗凋亡分子产生，促进细胞存活，从而发生致瘤作用。最后，通过对IL-6和TNF-α的研究，Park等为肝癌的预防和治疗提供了一个新的潜在靶点。 4.4 TNF-α与肺癌 在全球，肺癌的发病率和死亡率均癌症之首。近年来在我国发病率呈上升趋势，成为首位恶性肿瘤死亡原因。近年来发现炎症细胞因子在肺癌的发生、发展及转归中起重要作用。Yao LK1等[6]研究结果提示TNF-α在肺癌的发病和进展中起重要的调节作用，不仅将为肺癌的早期诊断提供可靠的理论基础，更为肺癌的治疗、药物的研制和筛查提供潜在的新靶点。 综上所述，TNF-α作为炎性因子，不仅只在炎症中表达增高，在肿瘤以及癌前病变中的表达也呈升高的趋势。TNF-α参与到全身各系统炎症与肿瘤性疾病的发生与发展之中。TNF-α在组织器官从炎症发展到癌变的过程当中，扮演了重要角色；并在恶性肿瘤的转移、浸润方面也具有关键作用。因此，TNF-α表达水平的增高预示着炎症反应的发生以及进一步加重，并提示有癌变倾向，对诊断早期病变有指导性价值。 参考文献： [1] Cosic I, Cosic D, Lazar K. Analysis of Tumor Necrosis Factor Function Using the Resonant Recognition Model. Cell Biochem Biophys. 2016 Jun;74(2):175-80. [2] Hu J, Yang T, Xu H. A novel anticancer agent icaritin inhibited proinflammatory cytokines in TRAMP mice. Int Urol Nephrol. 2016 Jun 9. [3] Marques CM, MacNeil S. Use of a Tissue Engineered Human Skin Model to Investigate the Effects of Wounding and of an Anti-Inflammatory on Melanoma Cell Invasion. PLoS One. 2016 Jun 7;11(6): [4] Yin Y, Chen X , Shu Y. Gene expression of the invasive phenotype of TNF-alpha-treated MCF-7 cells [J] . Biomed Pharmacother ,2009 ,63 (6) :421-428. [5] Eek Joong Park, Jun Hee Lee, etal. Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF expression. Cell, 2010, 140(2) :197-208. [6] Yao LK1, etal.Relationship between expression of HDAC2, IL-8, TNF-α in lung adenocarcinoma tissues and smoking. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2016 May 17;96(18):1410-3.
大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)说明书
大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：360ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞
肿瘤坏死因子α
肿瘤坏死因子α 文章目录*一、肿瘤坏死因子α的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、肿瘤坏死因子α的 正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、肿瘤坏死因子α 的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、肿瘤坏死因子α的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、肿瘤坏死因子α的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应 肿瘤坏死因子α的基本信息 1、定义α肿瘤坏死因子(TNF α)是一种主要由巨噬细胞和 单核细胞产生的促炎细胞因子,并参与正常炎症反应和免疫反应。α肿瘤坏死因子在许多病理状态下产生增多,包括败血症、恶性 肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。 2、专科分类肿瘤科 3、检查分类免疫检查 4、适用性别男女均适用 5、是否空腹空腹
肿瘤坏死因子α的正常值和临床意义 1、正常值 4.3±2.8ng/ml 2、临床意义测定血清或其他体液中TNF浓度,对原发性或继发性肾小球疾病、器官移植性排异、肿瘤、重症感染等疾病有诊断意义。 肿瘤:许多肿瘤细胞可产生TNF,因此在多种肿瘤时机体内TNF表达明显升高。TNF又可通过细胞毒作用,杀死肿瘤细胞或抑制某些肿瘤细胞增殖。 风湿性关节炎患者的滑膜中有大量TNF。 在脓毒败血症、感染性肺炎等严重炎性疾病时血清中TNF含量明显增高。许多寄生虫病患者中TNF也显著改变。艾滋病患者体液中TNF也高于正常人。疟疾抗原、病毒和细菌均可诱导TNF 产生,TNF又反过来具有抗病毒、抗细菌、抗疟疾作用。 TNF与移植排斥反应密切相关,在患者的血清或尿液中TNF 的表达与排斥反应程度呈正相关。 肿瘤坏死因子α的检查过程及注意事项 1、检查过程用双抗体夹心酶免疫分析法。将TNF α单克隆抗体包被于PVC板上,样品种的TNF α和单抗体结合后再与辣根过氧化物酶标记免抗TNFα多克隆抗体结合,过氧化物酶与TMB
人肿瘤坏死因子
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 药品名称： 通用名：人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析试剂盒 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆、或其它组织液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。 试剂盒组成 120倍浓缩洗涤液30ml×1瓶7终止液6ml×1瓶 2酶标试剂6ml×1瓶8标准品（450ng/L）0.5ml×1瓶 3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液2ml×1瓶 4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份 5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张 6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行实验。 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 3．可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为（300ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
人肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒
人肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒 产品编号：SEKH0047 适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本 仅供研究，不用于临床诊断
目录 背景介绍 (01) 检测原理 (01) 注意事项 (02) 安全提示 (02) 试剂盒组成及储存 (03) 自备实验器材 (03) 样品收集及储存 (03) 试剂准备 (04) 检测步骤 (06) 结果判断 (06) 参数表征 (07) 参考文献 (09) 常见问题分析及解决办法 (10)
背景介绍： TNF-α是一种主要由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子。人的TNF-α约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α分子量为17kDa。在氨基酸水平上，人与鼠的TNF-α有79％同源性，TNF-α的生物学作用无明显的种属特异性。人类多种细胞均可表达TNF-α，包括B细胞，结肠柱状上皮细胞，NK细胞，巨噬细胞，单核细胞，肥大细胞，中性粒细胞等。TNF-α的生物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节；对血管和凝血的影响和对多种器官（肝、心脏、骨、软骨、肌肉和其它组织）的作用。 检测原理： 本ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗人TNF-α单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人TNF-α会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗人TNF-α抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人TNF-α发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人TNF-α，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人TNF-α浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人TNF-α的浓度。 原理图：
重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性胸腔积液或腹腔积液的临床研究
目录 引言 (1) 研究对象与方法 (3) 结果 (7) 讨论 (11) 结论 (15) 参考文献 (16) 综述 (20) 附录 (29) 中英文对照缩略词表 (31) 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文 (32) 致谢 (33)
重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性胸腔积液或腹腔积液的临床研究引言 引言 恶性胸腔积液（malignant pleural effusion, MPE）是指由肺癌或其他部位恶性肿瘤累及胸膜或胸膜原发性肿瘤所致的胸膜腔积液[1]，是中晚期恶性肿瘤患者的常见并发症之一，常见于肺癌、乳腺癌和淋巴瘤[2]。肿瘤类型在男性和女性之间存在一定差异，男性常见为肺癌、淋巴瘤、胃肠道肿瘤；女性常见为乳腺癌、生殖道肿瘤、肺癌、淋巴瘤[3]。恶性胸腔积液的发生机制主要是肿瘤阻塞引起壁层胸膜血管和淋巴系统引流障碍，或肿瘤转移至纵隔淋巴结而导致胸腔积液吸收减少，或原发肿瘤和转移性病变直接侵犯和伴随的炎症增加毛细血管通透性所导致[4,5]。恶性胸腔积液常常进展迅速，且积液量较多，易并发肺不张和肺部反复感染[6]，影响心肺功能，造成严重的呼吸困难和循环功能障碍。恶性胸腔积液不仅严重影响患者的生活质量，而且大大降低了患者行进一步治疗的机会，甚至会促进患者死亡。及时诊断和治疗恶性胸腔积液能在很大程度上改善患者的症状及体征、提高其生活质量并且延长生存时间，对患者的后期治疗有着重要意义。目前治疗恶性胸腔积液的主要目的是缓解患者的各种严重症状、改善其生活质量[7], 并防止积液再次产生[8]。恶性腹腔积液是恶性肿瘤扩散转移至腹腔引起的腹腔内异常体液潴留[9]，它的出现往往也预示肿瘤已到晚期，据相关文献报道[10]，其一年生存率低于10%。恶性腹腔积液绝大部分是由于继发性恶性肿瘤侵犯腹膜引起的，如胃癌、卵巢癌、肠癌、胰腺癌等，极少数是由于原发的腹膜癌引起的。恶性腹腔积液的临床症状主要表现为腹胀、消化功能严重障碍、乏力消瘦，体检可发现腹围增大、移动性浊音阳性等。恶性腹腔积液具有顽固、难治、易复发的特点,不仅加快疾病进展,更严重影响患者的生存质量[11]。 关于恶性胸腔积液或恶性腹腔积液治疗的文献报道及临床研究颇多，主要涉及到外科手术治疗、全身化疗、放射治疗、胸腔穿刺和置管引流、局部腔内药物灌注治疗、中医治疗等方法[12-21]，各治疗手段均具有一定的疗效、适应症、禁忌症以及毒副反应，适用于不同的病例及肿瘤不同临床阶段。但总体上对恶性胸腔积液的治疗仍停留在姑息治疗阶段，通常是以胸腔的局部治疗为主[22]。胸腔局部用药如硬化剂、抗肿瘤药物、生物免疫制剂等，可直接抑制或杀伤肿瘤细胞以及促进胸膜粘连闭锁，从而抑制胸腔积液形成，疗效均比较好[23]。近年来， 1
TNF肿瘤坏死因子的介绍
肿瘤坏死因子（TNF） 1975年carswell等发现接种bcg的小鼠注射lps后，血清中含有一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生血坏死的因子，称为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,tnf)。1985年shalaby把巨噬细胞产生的tnf命名为tnf-α ，把t淋巴细胞产生的淋巴毒素（lymphotoxin,lt)命名为tnf-β。tnf-α又称恶质素。 1.tnf的产生 （1）tnf-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，lps是较强的刺激剂。ifn-γ、m-csf、gm-csf对单核细胞/巨噬细胞产生tnf-α有刺激作用，而pge则有抑制作用。前单核细胞系u937、前髓细胞系hl-60在pma刺激下可产生较高水平的tnf-α。t淋巴细胞、t细胞杂交瘤、t淋巴样细胞系以nk细胞等在pma刺激下也可分泌tnf-α。sac、pma、抗igm可刺激正常b细胞产生tnf-α。此外，中性粒细胞、lak、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生tnf-α。 （2）tnf-β是一种淋巴因子，抗原和丝裂原均可刺激t淋巴细胞分泌tnf-β。pma刺激rpmi1788b 淋巴母细胞可分泌高水平tnf-β。 2.tnf的分子结构和基因 （1）人的tnf-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与mhc基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。1984年从hl-60、u937等细胞中克隆成功rhu tnf-α cdna，并在大肠杆菌中获得高表达。人tnf-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型tnf-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。rhu tnf-α分子量为17kda。小鼠tnf-α前体为235氨基酸残基，信号肽79氨基酸残基，成熟的小鼠tnf-α（rmutnf-α）分子量为17kda，由156个氨基酸残基组成，第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。rhu tnf-α与rmu tnf-α有79%氨基酸组成同源性，tnf-α的生物学作用似无明显的种属特异性。最近有人报道通过基因工程技术表达了n端少2个氨基酸（val、arg）的155氨基酸人tnf-α，具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。此外，还有用基因工程方法，将tnf-α分子氨基端7个氨基酸残基缺失，再将8pro、9ser和10asp改为8arg、9lys和10arg，或者再同时将157leu改为157phe，改构后的tnf-α比天比天然tnf体外杀伤l929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明显增加。tnf-α和β发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。 （2）人和小鼠tnf-β基因分别定位于第6和第17号染色体。hutnf-β分子由205个氨基酸残基组成，含34氨基酸残基的信号肽，成熟型hu tnf-β分子为171个氨基酸残基，分子量25kda。rhu tnf-β分子由202氨基酸残基组成，包括33个氨基酸残基的信号肽，成熟分子169
肿瘤坏死因子的研究进展
文章编号: 1007-6611(2006)03-0311-04 肿瘤坏死因子的研究进展 吕志敢, 郭 政 (山西医科大学第二临床医学院麻醉科, 太原 030001) 关键词: 肿瘤坏死因子; 肿瘤坏死因子受体; 病理学; 免疫学 中图分类号: Q71,R392,R73 文献标识码: A 1975年,Carswell发现被细菌感染后的小鼠血清中有一种蛋白类物质可致肿瘤出血,并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞,被命名为肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TN F),又叫恶病质因子(cachectin)。从此对它的研究进入了一个新的时期,至今方兴未艾,几十年来取得了巨大的进展。本文对近年来有关TN F2α的研究进展作简要的综述。 1 TNF2α的生物学特性 人类TNF2α基因大小为2.76kb,由4个外显子和3个内含子组成,与MHC紧密连锁,定位于第6对染色体短臂上,小鼠的基因为2.78kb,与人的结构非常相似,定位于第17对染色体短臂上。TNF按其结构分两型:TNF2α和TNF2β,其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生的能使肿瘤坏死的因子称为TN F2α(旧称TN F),又称恶病质因子(cachectin);而把由活化的T细胞和N K细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin,L T)称为TN F2β,目前对其功能所知有限。目前研究较多的是TN F2α,它是一种由157个氨基酸组成、相对分子质量为17000的可溶性多肽,以二聚体、三聚体或五聚体的形式存在于溶液中,成熟型TN F2α的活性形式为三聚体。TN F2β基因位于TN F2α基因的5′端,相隔1.2kb,每个基因约有3000个碱基对,有4个外显子和3个内含子,其中第4个外显子与TN F2α高度同源,编码80%-90%的成熟蛋白质,这些均提示这两个基因来自同一个祖先。但前3个外显子和3个内含子都是不同源的,调节基因复制的5′端也有很大区别,这些说明这两个基因是不同的[1]。 2 TNF2α的来源与表达 TN F2α来源极广泛,体内的多种细胞,如单核/巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞、角质细胞、星形细胞和成骨细胞等均具有产生和释放TN F2α的能力。目前认为心、肝、肺、肾是TN F2α的生物合成场所[2]。TN F2α的主要刺激因素是脂多糖(L PS)、病毒、真菌、过敏毒素、IL21和免疫复合物等。 在正常情况下TN F2α仅在心肌间质的巨噬细胞中产生。G iroir等[3]的研究表明,成熟的心肌细胞在某些应激状态下也具有产生TN F2αmRNA及其蛋白质的能力,此时产生的TN F2α可直接影响心功能,参与了多种心脏病的病理过程。感染和内毒素血症是心脏产生TN F2α的重要刺激因素。Kapa2 dia等[2]证明在内毒素的刺激下心肌细胞和巨噬细胞几乎产生同样多的TN F2α。 体内TN F2α的表达具有高度的组织特异性。在生理条件下,脾、肝、肺、胸腺及肾脏的组织均有TN F2αmRNA的表达;而在脂多糖刺激后,心脏、胰腺、子宫及输卵管等多脏器均快速合成表达TN F2αmRNA及蛋白质[4]。 K leine等[5]证实,脑内多种在结构和功能方面与巨噬细胞相似的细胞如神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞在生理状态下均可合成分泌TN F、IL26等细胞因子,在炎症情况下这些因子水平多显著升高,并对中性粒细胞有明显趋化作用。 3 TNF2α受体(TNFR)的分类及表达 3.1 TN F2α的生物学活性主要是通过细胞膜上的特异受体传递信号而实现的,TN F2α受体(TN FR)广泛存在于肝、肺、肾、肠道及肌肉组织中。TN F2α与靶细胞膜上的TN FR结合产生生物学效应,通过受体后效应将信息传递到胞核,使mRNA表达并进而合成蛋白质。Douzinas等[6]认为,TN F2α等细胞因子一方面与脏器细胞膜上的受体结合产生效应;另一方面,细胞因子与循环中的可溶性受体结合,使循环中的细胞因子减少,但在组织中的表达却增加,其在局部中的过度生成导致脏器损害。 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30471656)
肿瘤坏死因子简介
肿瘤坏死因子 1975年E.A. Carswell等人发现接种卡介苗的小鼠注射细菌脂多糖后，血清中出现一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，将其命名为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF)。八十年代人们发现其在消耗症中起了重要作用，又称恶液质素。TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生。1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素（lymphotoxin，LT)命名为TNF-β。虽然TNF-α与TNF-β仅有约30%的同源性，但它们却拥有共同的受体。TNFα的生物学活性占TNF总活性的 70 %～95 %，因此目前常说的TNF多指TNF-α。1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第一个用于肿瘤生物疗法的细胞因子，但因其缺少靶向性且有严重的副作用，目前仅用于局部治疗。 1.别名:恶液质素（Cachectin）巨噬细胞毒素（Macrophage cytotoxin）坏 死素（Necrosin ）细胞毒素(Cytotoxin) 肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor-α) 出血因子(Hemorrhagic factor) 巨噬细胞毒性因子(Macrophage cytotoxic factor) 分化诱导因子(Differentiation-inducing factor) 2. 来源:巨噬细胞(Macrophages) 自然杀伤细胞(Natural killer cells) T淋巴细胞(T-lymphoblastoid Cells) B淋巴细胞(B-lymphoblastoid Cells) 肥大细胞(Mast cells) 成纤维细胞(Fibroblasts) 平滑肌细胞(Smooth muscle cells) 乳腺肿瘤细胞(Breast tumor cells) 卵巢肿瘤细胞(Ovarian tumour cells) 星形胶质细胞(Astrocytes) L-929细胞(L-929 cells) 枯氏细胞(Kupffer’s cells) 上皮细胞(Epidermal cells) 颗粒细胞（Granulosa cells）
人肿瘤坏死因子α(TNF-α)说明书
人肿瘤坏死因子人肿瘤坏死因子αα（TNF-α）酶联免疫酶联免疫分析分析分析 试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围检测范围：： 96T 20 ng/L -400 ng/L 使用目的使用目的：： 本试剂盒用于测定人血清样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），再与HRP 标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（800ng/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1个 标本标本要求要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 400 ng/L 5号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 200 ng/L 4号标准品 150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 100 ng/L 3号标准品 150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 50 ng/L 2号标准品 150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 25 ng/L 1号标准品 150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
ELISA法检测人血清血浆样本中肿瘤坏死因子α TNF-α的浓度
双抗体夹心ELISA法检测样本中TNF-α的浓度 TNF-α简介： 肿瘤坏死因子（TNF-α）是由单核细胞和巨噬细胞产生的多肽类细胞因子，在炎症反应、免疫系统的发展、细胞程序性死亡和脂代谢中起重要的作用。其功能主要是在免疫反应中是一个多功能的调节器甚至作为一个强烈的热原性物质刺激中性粒细胞，改变血管内皮细胞的特性，调节其它组织的代谢活性。TNF-α也可通过抑制脂蛋白脂肪酶的活性而导致恶液病。爱泼斯坦病毒引起的 细胞活化也可被TNF-α所抑制。 巨噬细胞表面的淋巴因子和肉毒素也可介导包括上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等产生TNF-α。据报道干扰素能显著提高TNF-α的分泌量。 TNF-α在关节炎和其它组织的炎症的发病机理中起重要作用。TNF-α也参与了包括哮喘、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、神经性疼痛、肥胖症、 型糖尿病、自身免疫病和肿瘤等疾病的发生 检测原理: 本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TNF-α的浓度。TNF-α捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的TNF-α会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TNF-α抗体后，抗人TNF-α抗体与TNF-α接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在TNF-α将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，TNF-α浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中TNF-α浓度。 实验过程需自备的材料： 1.不同规格的加样枪及相应的枪头； 2.酶标仪； 3．自动洗板机； 4．去离子水或双蒸水； 标本收集: 1.标本的收集请按下列流程进行操作： A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可； B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液； C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集； D. 若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。 2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂； 3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除； 4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。 注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。 检测前准备工作: 1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。 2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。 3. 标准品:加入去离子水0.6ml至冻干标准品瓶中使TNF-α终浓度达到1000pg/ml，静置15分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
肿瘤坏死因子(一)
肿瘤坏死因子(一) 作者：孙嗣国，马保安，周勇，范清宇 【关键词】,肿瘤坏死因子Osteoclastformationandboneresorptioninducedbytumornecrosisfactorα 【Abstract】AIM:Toinvestigatewhethertumornecrosisfactorα(TNFα)caninduceosteoclastformationfromperiph eralbloodmononuclearcells(PBMCs)independentofreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand( RANKL).METHODS:PBMCswereculturedinthepresenceofmacrophagecolonystimulatingfactor （MCSF）andTNFαinvitro.RANKLblockingagentRANK:FcandneutralizingantiTNFαantibodywererespectivelya ddedtotheculture.Attheendoftheculture,PBMCsculturedoncoverslipswerefixedandstainedfortartr ateresistantacidphosphatase(TRAP),https://www.360docs.net/doc/ba651975.html,cunaresorptionondentineslices,afunct ionalmarkerofosteoclast,wasalsoobservedusingscanningelectronmicroscopyandlightmicroscopy.R ESULTS:TNFαinducedtheformationofmultinucleatedcells(MNCs)whichwereTRAPpositiveandshow edevidenceoflacunaresorptionpitformationondentineslices.RANK:Fcdidnotinhibitthisprocesswhil eneutralizingantiTNFαantibodycompletelyblockedboththeformationofMNCsandlacunaresorption. CONCLUSION:InthepresenceofMCSF,TNFαcandirectlyinducemononuclearphagocyteosteoclastpre cursorstodifferentiateintoosteoclasticcellscapableoflacunaresorption. 【Keywords】TNFα;osteoclast;boneresorption 【摘要】目的：验证肿瘤坏死因子α（TNFα）是否可以直接诱外周血单核细胞（PBMCs）分化为具有骨吸收作用的破骨细胞.方法：小白鼠PBMCs体外培养中加入TNFα和白细胞介素1α（IL1α）及巨噬细胞克隆集落刺激因子（MCSF）；同时，分别加入细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的拮抗剂RANK:Fc和抗TNFα中和抗体.对培养终末细胞作组织化学染色，检测破骨细胞特征性标志物抗酒石酸磷酸酶（TRAP）的表达；并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成为指标检测其生物学活性.结果：PBMCs体外培养形成大量TRAP阳性的多核细胞（MNCs）；象牙磨片上见到虫蚀样骨吸收陷窝，后者的面积对TNFα呈剂量依赖性.RANK:Fc 对此现象无抑制作用，而抗TNFα中和抗体可完全阻断该现象的发生.结论：TNFα能够直接诱导PBMCs分化为具有骨吸收功能的破骨细胞. 【关键词】肿瘤坏死因子α；破骨细胞；骨吸收 0引言 破骨细胞是由单核巨噬系统的破骨细胞前体细胞分化而来的多核细胞(MNCs).多种炎性及非炎性的骨与关节的病变，如骨质疏松、风湿性关节炎、无菌性松动等都与破骨细胞代谢异常有关.近年来的研究表明肿瘤坏死因子(TNFα)通过多种方式参与破骨细胞的分化及生物学活性的调控〔1,2〕.在本实验中，我们将小白鼠外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)及RAW246.7细胞体外培养，并加入TNFα及其他因子，验证TNFα是否可以直接诱导破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试剂αMEM中加入100u/mL青霉素，10mg/L链霉素和10mmolL谷氨酸及100mL/L胎牛血清(Invitrogen,UK)配制成完全培养基(MEM/FBS)；重组人巨噬细胞克隆刺激因子（MCSF）、鼠可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体(solvablereceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand,sRANKL)、RANKL拮抗剂（RANK:Fc），TNFα，IL1α，抗TNFα中和抗体均购于R&DSystems公司（UK），抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于Sigma公司（UK）.