转基因小鼠的制备

显微注射法

这一方法的实验程序如下：

⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；

⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配。次日从输卵管内收集受精卵备用；

⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；

⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；

⑸对幼鼠的鉴定：

①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；

②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；

③自小鼠内脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。亦可取胚胎进行分析。显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。

基因打靶与基因剔除技术

ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner cell mass）中分离出来的。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。

基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。该方法的一般策略如下：

基因剔除----如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。多采用突变基因（mutated gene）剔除正常基因以产生定位突变（target mutation）。即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。

目前筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positive and negative selection,pns）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推pns法。其基本原理是：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neo r基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（hsv-tk）基因作为负选择，hsv-tk基因由邻近的neo r基因启动子调

节。用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（g418）和致死核苷类似物（ganc）作双重筛选。因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，hsv-tk+基因产物可使ganc转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neo r基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗g418有正选择作用，对ganc无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺apoe基因的tgm模型，并利用这一as小鼠模型研究了饮食和遗传因素对as的影响。

条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。目前多采用cre-loxp重组系统（cre-loxp-mediated gene replacement ,cre-loxp recombination system）。其中cre重组酶来源于侵染大肠杆菌p1噬菌体。分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxp的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。在cre酶存在时，两个loxp位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxp位点。其原

理如上图所示。研究发现，在哺乳动物细胞中cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的更加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破。

Cre酶作用原理

1、cre基因转译成cre酶；

2、cre酶作用于基因组上loxp位点；

3、cre酶使两个loxp 位点联合；

4、两个loxp位点发生同源重组切除x基因及一个loxp位点而仅留下一个loxp 位点。

1、有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；

2、将一个loxp位点插在野生型基因片段的3’端；

3、将新构建的DNA序列整合到基因组上；

4、在cre酶的作用下切除hsv-tk、neo r野生型基因及一个loxp位点；

5、经过cre-loxp重组系统作用后所形成的DNA序列。

Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因hsv-tk及neo r、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。在此新构建的DNA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxp位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码cre 重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxp位点之间的hsv-tk、neo r及正常的野生型基因均在cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxp位点，其cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除程序如上图所示。

基因打靶

目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：

导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；

导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；

外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；

导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。

为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。

同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术

ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。

转基因小鼠的鉴定

转基因小鼠的鉴定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1.剪取小鼠长度为的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混匀。 2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品均匀分离。注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。

2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4.14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。 5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9.12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

转基因小鼠的制备

转基因小鼠的制备【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。【实验原理】转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。【实验步骤】一、显微注射法 1.受精卵的采集可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入

Dicer1转基因小鼠模型的建立

2008年8月第16卷　第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16　N o.4 研究报告 Dicer 1转基因小鼠模型的建立郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1 , 吕相川1,张梅英1,王禄增 1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳　110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳　110001) 【摘要】　目的　建立Dicer 1转基因小鼠模型。方法　构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。结果　显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论　成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。【关键词】　Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203 Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse Model ZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1 , LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(https://www.360docs.net/doc/e510763073.html,boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ; 21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China ) 【Abstract 】　Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA. 【K ey w ords 】　Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice [基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。 [作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与基因敲除。E -mail :zhihongzheng @1631com [通讯作者]王禄增。E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是 2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表达。其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA 剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。 DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶, DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。1　材料方法 111　Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以

转基因小鼠的方法概述

转基因小鼠的应用及其制备法学院：动物科技学院专业班级：学生姓名：学号：指导老师：时间：2015年12月17日

老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。转基因小鼠的应用及其制备法

（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100）摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic）上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与

转基因小鼠的方法概述

转基因小鼠的应用及其制备方法学院：动物科技学院专业班级：学生姓名：学号：指导老师：时间：2015年12月17日

老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都弄懂，愿老师见谅。

转基因小鼠的应用及其制备方法（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.360docs.net/doc/e510763073.html,；Tel： *通讯作者：E-mail：兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

AD转基因小鼠的鉴定

转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混匀。 2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品均匀分离。注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。 2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4.14000rpm 离心1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。 5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振

荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9.12000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。 10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入 50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。注意： 1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH 值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。 2）离心前室温孵育5min可增加产量。 3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。 4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。三、PCR PCR程序设定： 1＝94.0℃for 5:00 2＝94.0℃for 1:00 3＝59.0℃for 0:50 4＝72.0℃for 1:00 5＝Goto 2 2times 6＝94℃for0:50 7＝58℃for 0:50 8＝72℃for 1:00 9＝Goto 6 2times 10＝94.0℃for 0:50 11＝56.0℃for 0:50 12＝72.0℃for 1:00

转基因小鼠制备实验方法

转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)

转基因小鼠制备

1. 基因准备 2. 实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。 2.1 供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。 2.2 受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。 2.3 结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。用作母鼠假孕的结扎公

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１）＊通讯作者文章编号：１００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６ＴＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究王　红１，２，３，蒋　莉４，王　岩５，许振凯６，王威平６，方　航１，２，３，孙　鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１．南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１；５．吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０；９．肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的　为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠，提供稳定的动物模型。方法　取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果　杂交后分别获得肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组比较，上述３种转基因小鼠ｐ－Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论　本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高，有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。关键词：基因敲除小鼠；骨发育；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉ４，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ５，ｅｔ　ａｌ．（１．Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇ　ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｊｉ　Ｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｂｏｕｔ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏ－ｖｉｄｅ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｏｂｔａｉｎ　８ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ．Ａｎｄ　ｐ－Ｓ６ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｂｙ　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｈａｖｅ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，２０１９，２３：１２３９）结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ｃｏｍ－ｐｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学　２０１９年７月　第２３卷　第７期

转基因小鼠制备实验方法

转基因小鼠制备实验方法（protocol) 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位臵，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放臵，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱

培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)