PCR技术用于基因突变的检测

PCR 技术用于基因突变的检测

基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因结构多态性异常等形式。许多人类遗传性疾病源于基因的突变,基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列等位基因改变的鉴别,对诊断和理解遗传病有非常重要的价值。

聚合酶链反应 (PCR)是一种高特异和高灵敏性的基因分析手段, PCR 操作简便, 可以在几个小时内使 DNA 段的拷贝数扩增百万倍, 使对微量 DNA 的分析鉴定成为可能,伴随着分子生物学各领域的飞速发展, PCR 及其衍生技术以其快速准确在基因突变的检测中得到了广泛的应用。

虽然特异基因序列区段的直接测序是基因突变分析最可信和最精确的手段 , 但该方法繁琐、耗时、费力。 PCR 的应用则提供了一系列比直接测序更方便、快捷的方法。 PCR 在此领域也引起了巨大的革新。

基于 PCR 技术的常用基因突变检测方法有:

1、 PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸 ) PCR/ASO探针诊断点突变,系在扩增 DNA 段后,直接与相应的寡核苷酸探针杂交,来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。

2、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR-SSCP 系 1989年由 Orita 首先报道的,它是一种基于单链 DNA 构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高,是目前检测点突变最简捷的方法。

3、 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism , RFLP , 限制性片段长度多态性分析 )RFLP 分析与 PCR 反应相结合, 先用 PCR 来扩增待检的片段,再进行 RFLP 来检测那些发生在酶切位点的突变简化了 RFLP 的分析过程,并使该项技术得到了广泛的应用。

4、 DNA 序列测定法 (direct sequencing, DS)

PCR 产物经克隆后测序或直接对 PCR 产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的,不仅可以确定突变的部位,还可以确定突变的性质。尤以循环测序法最具有代表性,该方法以 TaqDNA 聚合酶代替测序酶。测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成,具有快速、简便、灵敏等优点。但是DNA 序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。

5、异源双链分析 (heteroduplex analysis, HA) 该方法类似于 SSCP 。在一个PCR 反应中, 如果同时存在野生型和突变型的 DNA 模板, 那么在 PCR 循环中突变型和野生型 DNA 形成的杂合双链 DNA 分子即异源双链 DNA 段, 它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率,经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开,从而达到诊断碱基突变的目的。该方法依赖于双链 DNA 分子序列依赖性的构象变化。对于小于 300bp 的小 DNA 段其敏感性较好,且已在许多遗传性疾病中得到应用。

6、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)DGGE 是一项根据 DNA 解链特性分离鉴定 DNA 段的技术。在温度和变性剂浓度增加时, DNA 分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。 PCR 扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时,一旦

进入相当于某些区域解链温度 (Tm)的变性剂浓度区将会解链形成分叉的 DNA 分子, 并因此使迁移率显著下降。变性区域的解链温度 (Tm)由其核苷组成决定, 序列中发生一个碱基的改变,其解链温度 Tm 改变1.5℃,在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。同 SSCP 比较, DGGE 需要制备新鲜的梯度胶,检出率也较低,且只能确定突变的存在,不能进行突变位置和性质的定量分析。但 DGGE 无需知道待测片段的 DNA 序列,无需制备测试引物。

7、化学错配裂解法 (chemical mismatch cleavage, CMC) CMC是将同位素标记过的野生型 DNA 分子和突变型 DNA(或 RNA) 段混合后经过变性与复性 , 形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 的异源杂交双链,在突变部位会产生凸起。对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。 CMC 法最大优点是能对放大片段进行“ 扫描” 式分析 , 存在于序列中任何部位的突变都能被检出 , 多用于多基因突变的遗传病。

此外还有等位特异性 PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、 PCR 核糖体分型(ribotyping)技术、可变数目 ***重复 (variable number tandem

repeats,VNTR) 序列和短 ***重复 (short tandem repeats,STR) 序列分析等方法可用于基因突变的分析。这些方法各有所长,具有不同的优缺点, 在不同的领域内有着不同的应用。无论是哪种检测技术都体现了 PCR 技术本身所具有的优越性 , 在实际应用时,可根据实验目的和具体需要,选择最恰当的方法或将不同的方法联合应用, PCR 的应用将使基因突变检测技术有更广阔的应用前景。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变一、教学目的与要求：（1）了解基因突变的类型和性质、特征（2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式（3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。（2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。三、教学方法设计：四、教具或教学手段：多媒体课件五、教学过程与板书设计：

第一节基因突变的概念和特征一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时间内突变可能发生的次数。高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病苯丙氨酸羟化酶苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸积累尿黑尿酸氧化酶酪氨酸酶苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

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此文档下载后即可编辑基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过

荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有： (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。

基因突变检测多少钱检测方法是什么

基因突变检测多少钱检测方法是什么一代测序法（Sanger法）：科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的，现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片或高通量检测高100倍。 Taqman法：准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。质谱法：准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会出现少量假阳性和假阴性。二代基因检测芯片法：适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶向药物治疗事倍功半。肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。

基因突变的鉴定

基因突变的鉴定 (2010-07-05 17:37:50) 转载▼ 标签：杂谈一．植物形态突变的鉴定经人工诱发或自然发生的变异是否属于真实的基因突变，是显性突变还是隐性突变，突变频率的高低等，都应进行鉴定。 1．真实遗传变异的鉴定变异有可遗传的变异，有不可遗传的变异。基因本身发生化学性质的变化而引起的变异是可以遗传的，因环境条件而导致的表现型变异是不遗传的。所以，在诱变处理材料的后代中一旦发现与原始亲本不同的变异体，首先要鉴定它是否真实遗传。例如，在农作物诱变育种过程中，某种高杆植物经理化因素处理后，在其后代中发现个别矮杆植株，这种变异究竟是基因突变引起的呢？还是由环境条件引起的呢？二者如何鉴别呢？把变异体与原来的亲本种植在土壤条件和栽培条件均匀一致的环境下，若变异体与原始亲本的表现大体相似，即原来的变异消失了，说明它不是遗传的变异；反之，若变异体与原始亲本不同，仍然表现为矮杆，说明它是基因突变的结果。 2．如何鉴别显性突变和隐性突变利用杂交试验的方法，可以区分显性突变还是隐性突变。以上例而言，让矮杆突变体植株与原始亲本杂交，若F1表现高杆，F2中既有高杆，也有矮杆植株，说明矮杆突变是隐性突变。若是显性突变情况又如何呢？F1表现为矮杆，F2中矮杆：高杆为3：1。 3．利用花粉直感现象估算配子的突变率为了测定玉米子粒非甜籽变为甜粒（Su→su）的基因突变频率，以甜粒玉米纯合体作母本，用经诱变处理过的非甜粒纯合体的花粉授粉。 susu×SuSu 在正常情况下，非甜（Su）对甜(su)为显性，授粉后的果穗应该完全是非甜粒种子，假如在果穗上发现甜粒种子，就可以认为是Su花粉经诱发处理以后发生了Su→su突变，并可计算出突变频率。

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）二、实验方法 1、样品采集，送检和保存乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

基因突变的检测方法

pcr检测技术

《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1．前言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定

量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： [1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因； [3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变； 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

KRAS基因突变的检测及其临床意义

KRAS基因突变的检测及其临床意义 RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。RAS 基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。 RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。2009年7月15日，美国FDA批准了对帕尼单抗和西妥昔单抗的说明书的修改，在西妥昔单抗和帕尼单抗说明书的“适应证和用法”部分明确指出，KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。此外，研究表明，K-ras基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，直肠癌患者中K-ras的突变对西妥昔单抗等药物的耐药性有关。美国国家癌症综合网络(NCCN) 2011年版临床治疗指南指出：K-ras基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标，肿瘤患者在接受EGFR靶向药物治疗前必须进行K-ras基因突变检测，以帮助决定患者是否接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等）治疗。携带K-ras永久激活性突变的患者本检验所不建议使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等），建议使用靶向的Ras抑制剂药物治疗。作为RAS/FTI（法尼基转移酶抑制剂）的安卓健通过抑制Ras 的活性，进而影响其下游讯息传递因子，包括抑制PI3K 的表现量与降低Akt 的磷酸化程度；以及活化AMPK促使TSC1/TSC2 结合更紧密，进而大大的降低mTORC1 的活性，开启癌细胞的自噬作用机制；安卓健同时会活化MEK1/ ERK1/2 的路径，促进癌细胞的自噬作用机制；另外，安卓健会使线粒体不稳定，降低Bcl-2、Bcl-XL 与MCl-1 的蛋白质量，使癌细胞程序性凋亡。由于安卓健能同时诱导癌细胞启动自噬作用与程序性凋亡的机制，而实验室的细胞毒性测试亦指出安卓健对多数的癌细胞（脑癌、淋巴癌、血癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、胰脏癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌与膀胱癌等) 都有药用效果。上海佳辰投资发展有限公司联合上海张江转化医学研发中心研发K-ras基因突变检测，详细如下：检测内容：K-ras基因突变检测方法：ARMS法主要材料：ABI荧光定量试剂盒主要设备：ABI 7500荧光定量PCR仪检测项目和样本类型：

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适

PCR技术在食品检测中的应用汇编

许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用

PCR技术在食品检测中的应用许昌学院食品与生物工程学院，河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别，该方法操作繁琐，有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌，使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点，所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点，包括：多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望，为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。关键词：食品检测；微生物培养；聚合酶链式反应；食品安全问题

、、■ 刖言食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物，而且它能最直接的与人体接触，进入人体的消化系统，所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业，在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物，这将严重危害食品的品质和人们的健康，甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、特异性、简便、快速的优点，现已广泛应用于微生物检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面，具有常规方法无法比拟的优越性。随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是聚合酶链反应（PCR）成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食品的检测，具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下，以单链DNA或RNA为模板，以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物，在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特异性的引物外，还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液（dNTP）、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸3个基础步骤。反应时，首先将靶DNA双链加热变性为单链状态，然后降低溶液温度，加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物，使合成引物在低温下与其靶序列特异配对，形成部分双链。然后，在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5 '末端向3 '末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度，由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期，每个周

preMiD基因突变检测技术原理和应用

preMiD?基因突变检测技术原理和临床应用简介：原癌基因和抑癌基因的驱动突变（driver mutation）是肿瘤特有的标记。以PreGen-Plus?筛查大肠癌4基因突变的粪便筛查被FDA批准为标志，更多突变检测肿瘤的新技术和产品处于临床开发阶段。自主创新的preMid?技术可一次检测38个基因198突变点，覆盖包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌和胃癌等14种肿瘤，国际上第一次实现多突变的血浆检测。临床验证preMid?技术可实现癌症（超）早期，疑似患者的辅助诊断和术后复发的实时监控，总体准确率可达80%。正文：原理： 1. 突变——肿瘤特异标志。癌症是基因突变累积的结果。“所有癌症的发生，都源自脱氧核糖核酸（DNA）序列的异常。”国际癌症基因组联合计划参与单位之一、英国剑桥大学桑格研究所首席科学家斯特拉顿教授指出。癌变的形成要经过8--10年甚至更长，而这漫长的时间其实就是一个多基因突变并累积的过程（图1）。肿瘤相关基因可分为原癌基因和抑癌基因，其中起主要作用的突变属于驱动型突变（driver mutation）。当抑癌基因突变失去抑制癌症作用，或原癌基因突变激活，就会诱发癌症。正常细胞在向癌细胞转化的过程中，发生多种不同原癌基因和抑癌基因突变。图1 肿瘤是基因突变的结果相比临床检测中常规使用的肿瘤蛋白血清标志物，突变无疑是更特异的肿瘤标记。 2009年12月，桑格研究所在《自然》杂志上刊文宣布，他们率先在世界上破译肺癌、

皮肤癌和乳腺癌等5种肿瘤全部基因密码，绘制出相应的肿瘤基因突变图谱（表1）。表1 5种癌症基因突变相关数据 Nature.2010.8;466(7308):869-873. 2.循环DNA是检测突变的重要来源肿瘤起源DNA存在于血液循环DNA中。循环DNA存在于血清或血浆、滑膜液和脑脊液等体液中的非细胞里面存在的片段，亦称细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。早在1947年Mandel和Metais就发现循环核酸；30年后Leon等研究表明肿瘤患者外肿瘤患者cfDNA水平大大高于正常人1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征；5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌基因突变，与原发肿瘤一致。图2 肿瘤cfDNA来源示意图肿瘤细胞cfDNA如何进入血液，目前认为：1) 循环肿瘤细胞或微转移灶的裂解；2) 肿瘤细胞的凋亡；3) 肿瘤细胞坏死；4) 肿瘤细胞自发性释放。 cfDNA突变检测具有特异、实时且无创等突出特点，无疑是肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发等有效靶标。

基因变异的研究方法与进展

基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种一、筛选性方法有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等 1 RNase 法该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C

左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点 2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。 CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件； (4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析 3 SSCP法单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材 QIAamp?DNA Blood Mini Kit（GIAGEN，德国) Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,11304-102） Nuclease-Free Water(Promega,P1195) d NTP Mix(Promega,P151B) PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DNA分子定量标准：DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物) PCR产物回收纯化试剂盒（BioSpin GelExtraction kit，日本Bioer技术有限公司） 0.5~10 μl、2~20 μl、20~200 μl、200~1000 μl吸头（美国Axygen，公司） EP管 3、仪器 Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）； Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国） Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter公司，美国） MVS-1型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）移液器2 μl、10 μl、50 μl、200 μl、1000μl（Eppendorf公司，德国）Ⅱ级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR公司，美国） X-15R高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国） Eppendorf Mastercycter PCR仪（Eppendorf 公司德国）电泳仪：Universal 024BR（Bio-Rad公司，美国）电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）凝胶成像分析系统：Tocan240全自动凝胶成像系统（中国）测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20μl、200μl和1000μl加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）二、实验方法 1、样品采集，送检和保存