TGF_1介导的RhoA_ROC_省略_鼠肺肌成纤维细胞分化中的调节作用_马文东

［文章编号］1000-4718（2013）10-1758-06

［收稿日期］2012-11-19

［修回日期］2013-09-04

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目（No．81072254）；人事部留学人员科技活动项目（No．国人厅发［2006］164号）；河北省自然科学基金资助项目（No．C2011401024）△通讯作者Tel ：0315-

3725495；E-mail ：fangyang02@sohu．com TGF-β1介导的RhoA /ROCK 通路在大鼠肺

肌成纤维细胞分化中的调节作用

*

马文东1

，袁

媛1

，杨

奕2

，徐

洪1，邓海静1，于婉莹1

，孙

月1，魏中秋3

，杨

方

1△

（河北联合大学1医学实验研究中心，2教务处，3病理学教研室，河北唐山063000）

［摘

要］目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）介导的RhoA /Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK ）通

路在调控肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中的作用。方法：胰酶消化法获得原代培养的肺成纤维细胞，进行以下实验：（1）观察TGF-β1诱导肺成纤维细胞不同时间后p-RhoA 、ROCK 、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基（p-MBS ）、血清应答因子（SRF ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）、I 型和III 型胶原蛋白表达变化；（2）将细胞分为对照组、TGF-β1诱导分化组和Y-27632（ROCK 通路阻滞剂）干预组，免疫细胞化学染色与Western blotting 法分别观察与检测ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-SMA 、I 型和III 型胶原蛋白在细胞内的定位分布与表达。结果：（1）经TGF-β1诱导24h 后，大鼠肺成纤维细胞胞体内出现大量平行或交叉排列的α-SMA 抗体标记的肌丝。随着TGF-β1诱导刺激时间的延长，p-RhoA 、ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-SMA 、I 型和III 型胶原蛋白表达逐渐增高，其中RhoA /ROCK 信号（p-RhoA 、ROCK 、p-MBS ）、SRF 和α-SMA 蛋白分别在诱导后6h 、12h 和24h 达到高峰。I 型胶原和III 型胶原蛋白表达均在24h 达高峰，分别为诱导前的2．19和3．04倍（P ＜0．05）。（2）与TGF-β1诱导分化组比较，当给予Y-27632干预后，在相应时点ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-SMA 、I 型和III 型胶原蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论：TGF-β1通过ROCK 信号转导通路的活化，刺激了大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，进而促进了胶原蛋白的合成，可能在（矽）肺纤维化形成过程中发挥着重要作用。

［关键词］转化生长因子β；Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶；肌成纤维细胞；肺纤维化［中图分类号］R135．2

［文献标志码］A

doi ：10．3969/j．issn．1000-4718．2013．10．006

Regulation of rat pulmonary fibroblasts differentiation into myofibro-blasts though RhoA /ROCK pathway mediated by TGF-β1

MA Wen-dong 1，YUAN Yuan 1，YANG Yi 2，XU Hong 1，DENG Hai-jing 1，YU Wan-ying 1，

SUN Yue 1，WEI Zhong-qiu 3，YANG Fang 1

（1Medical Research Center ，2Dean's Office ，3

Department of Pathology ，Hebei United University ，Tangshan 063000，China．

E-mail ：fangyang 02@sohu．com ）

［ABSTRACT ］AIM ：To investigate the regulatory effect of RhoA /Rho-associated coiled-coil-forming protein ki-nase （ROCK ）pathway mediated by transforming growth factor β1（TGF-β1）on the differentiation of pulmonary fibroblasts into myofibroblasts．METHODS ：Primarily cultured fibroblasts were obtained by trypsin digestion from the lung of neonatal rats．The fibroblasts were stimulated with TGF-β1for different durations and were divided into control group ，TGF-β1in-duction group and Y-27632treatment group．The distribution and expression of p-RhoA ，ROCK ，phosphorylated myosin binding subunit of myosin light chain phosphatase （p-MBS ），serum response factor （SRF ），α-smooth muscle actin （α-SMA ），

type I collagen and type Ⅲcollagen in the cells were detected by the methods of immunocytochemistry and Western blotting．RESULTS ：A lot of parallel and cross arranged filaments labeled by α-SMA antibody appeared in the cells after TGF-β1stimulation．The cultured cells stimulated with TGF-β1were all myofibroblasts at 24h determined by immunocyto-chemistry．The expression levels of p-RhoA ，ROCK ，p-MBS ，SRF ，α-SMA and type I and type III collagens were in-creased gradually with the extension of TGF-β1stimulation time．The expression of RhoA /ROCK signaling protein in the cells stimulated with TGF-β1（peaking at 6h of exposure ）was 2．96folds higher as compared with the non-stimulated cells．The expression of SRF protein （peaking at 12h of TGF-β1exposure ）was 4．55folds higher as compared with the non-sti-·

8571·中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology 2013，29（10）：1758-1763

mulated cells．The expression levels ofα-SMA and type I and type III collagens（peaking at24h of TGF-β

1

exposure）

were4．06folds，2．19folds and3．04folds higher as compared with the non-stimulated cells，respectively．Compared with

TGF-β

1

induction group，the protein expression levels of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA and type I and type III collagens

were significantly decreased at the corresponding time points in Y-27632treatment group．CONCLUSION：TGF-β

1

in-duces the differentiation of pulmonary fibroblasts into myofibroblasts，and then promotes the synthesis of collagen through the activation of ROCK pathway，which possibly plays an important role in the formation of pulmonary fibrosis．［KEY WORDS］Transforming growth factor beta；Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase；Myofibro-blasts；Pulmonary fibrosis

以往的研究认为，在致肺纤维化各种刺激因素的作用下，肺间质成纤维细胞的增殖与合成大量细胞外基质是肺纤维化发生发展的关键环节。然而近期的研究发现，在长期受到致纤维化因素刺激时，肺间质成纤维细胞和上皮细胞，会发生表型转变并分化为肌成纤维细胞（myofibroblast）。肌成纤维细胞能特异表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle ac-tin，α-SMA），被认为是（矽）肺纤维化形成过程中产生过量细胞外基质最主要和最重要的细胞［1-2］。而转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）是研究最多、最为深入并诱导肌成纤维细胞分化效果最为明显的细胞因子之一［3-5］。近年来研究发现TGF-β介导的Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK）信号转导通路在器官纤维化形成中发挥着重要作用［6］。本实验旨在观察与探讨TGF-β1刺激诱导的RhoA/ROCK信号转导途径在调控肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中的作用，为进一步深入研究（矽）肺纤维化形成机制提供一些实验的依据。

材料和方法

1肺成纤维细胞培养

取新生Wistar大鼠，胰酶消化法获得原代培养的肺成纤维细胞，取第4代细胞用于实验。诱导前将细胞调整同步化后，实验被分为2部分：第1部分给予TGF-β1诱导刺激肺成纤维细胞0min、5min、15 min、30min、45min、1h、3h、6h、12h、24h和48h。第2部分将细胞分为3组：（1）对照组：0．4%血清浓度的DMEM培养液；（2）TGF-β1诱导刺激组：0．4%血清浓度的DMEM培养条件下，给予TGF-β1（5μg/L）刺激后孵育细胞；（3）Y-27632干预组（Rho/ROCK通路阻滞剂组）：为0．4%血清浓度的DMEM培养条件下，给予RhoA/ROCK通路特异性阻滞剂Y-27632（10mg/L）预孵育1h后，再给予TGF-β1（5μg/L）共同孵育，选择诱导6h、12h和24h3个时点进行实验。2主要试剂

重组人TGF-β1（Peprotech）、Y-27632（Cayman Chemica）；GAPDH I抗（Santa Cruz）、β-actin I抗（Santa Cruz）；I型、III型胶原I抗（BA2023、BA0326，武汉博士德）、α-SMA I抗（Epitomics）、ROCK-I I抗（Epitomics）、血清反应因子（serum response factor，SRF）I抗（Santa Cruz）；p-RhoA（Ser188）I抗（Affini-ty）、RhoA I抗（Affinity）；肌球蛋白磷酸酶靶亚基（myosin phosphatase target subunit，MYPT；亦称为myosin-binding subunit of myosin light chain phospha-tase，MBS）I抗（Anbo）；p-MBS（Thr850）I抗（Milli-pore）。

3主要方法

3．1免疫细胞化学染色法检测α-SMA在肺成纤维细胞的表达常规制备细胞爬片，多聚甲醛固定2 h。免疫细胞化学染色按说明书进行，其中α-SMA 抗体浓度为1?200，DAB显色。染色时设置阴性对照，PBS取代I抗。将染色后的细胞爬片经IPP7．0图像分析软件进行图像采集。

3．2Western blotting检测ROCK、SFR、α-SMA、I型和III型胶原蛋白的表达RIPA蛋白裂解液裂解、离心，吸取上清。以考马斯亮蓝R-250染色测定蛋白浓度后，以每泳道50μg蛋白含量上样，常规电泳并转膜。5%牛血清白蛋白37?封闭1h，在膜上滴加封闭液稀释的抗大鼠的抗体（β-actin和GAPDH 抗体1?500稀释；余抗体1?100稀释），4?孵育过夜。II抗（1?3000稀释）37?孵育1h。BCIP/NBT（1?50稀释）显色。见有清晰条带出现即用双蒸水终止显色。用扫描仪对PVDF膜上蛋白表达条带进行图像扫描，以ImageJ软件对蛋白表达条带进行平均吸光度值（average absorbance，A）的定量分析，经内参平衡（GAPDH或β-actin）后，以对照组的倍数作为该蛋白的相对表达量）。

4统计学处理

数据以均数?标准差（mean+SD）表示，用SPSS 13．0软件进行完全随机设计的单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

·

9571

·

结

果

1

TGF-β1诱导不同时点p-

RhoA 、ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-SMA 、I 型和III 型胶原蛋白表达的变化免疫细胞化学染色结果显示（图1），经TGF-β1诱导后大鼠肺成纤维细胞形态由未加刺激时的瘦长梭形逐渐转变为宽大、

多边形，胞体内出现大量平行或交叉排列的α-SMA 抗体标记的肌丝。其中诱导3h 即可见胞体内肌丝，24h 几乎所有的细胞胞体内均

有肌丝，细胞都转化为肌成纤维细胞。Western blot-ting 法结果显示（图2、表1），经TGF-β1分别刺激0min 、5min 、15min 、30min 、45min 、1h 、3h 、6h 、12h 、24h 和48h ，p-RhoA 、ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-SMA 、I 型和III 型胶原蛋白表达均在刺激5min 后表达即开始上

调。其中p-RhoA 、ROCK 和p-MBS 蛋白多在6h 左右达到峰值，是诱导前的2倍左右；SRF 蛋白在12h 达

到峰值，是诱导前的4．55倍；α-SMA 表达在24h 达到峰值，是诱导前的4．06倍；I 型胶原蛋白和III 型胶原

蛋白表达在24h 达到峰值，

分别为诱导前的2．19和3．04倍

。

Figure 1．The expression of α-SMA in rat pulmonary fibroblasts

induced by TGF-β1measured by immunocytochemistry （?400）．Treatment with TGF-β1．A ：0min ；B ：3h ；C ：6h ；D ：12h ；E ：24h ；F ：48h．The arrows indicate the positive expression of α-SMA．图1

TGF-β1刺激后肌丝样结构随时间变化在大鼠肺成纤

维细胞内分布与表达情况

Figure 2．The expression of p-RhoA ，ROCK ，p-MBS ，SRF ，α-SMA ，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-de-pendently induced by TGF-β1．

图2

TGF-β1诱导刺激不同时点p-RhoA 、ROCK 、p-MBS 、SRF 、α-

SMA 、I 型和III 型胶原蛋白的表达·

0671·

表1TGF-β

1

诱导刺激不同时点p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白表达的变化

Table1．The expression of p-RhoA，ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-de-

pendently induced by TGF-β

1

（Mean?SD．n=3）

Protein0min5min15min30min45min1h3h6h12h24h48h

p-RhoA/t-RhoA1?01．14?0．071．26?0．181．24?0．171．78?0．19*2．01?0．24*1．86?0．17*2．42?0．32*1．89?0．33*2．09?0．04*1．70?0．62* ROCK1?01．73?0．711．89?0．541．62?1．071．84?1．461．67?1．062．44?1．722．96?1．22*2．61?1．23*2．68?0．85*1．88?0．58

p-MBS/t-MBS1?01．08?0．311．27?0．261．32?0．221．35?0．261．36?0．071．66?0．16*2．07?0．53*2．16?0．71*2．25?0．35*2．06?0．41* SRF1?01．37?0．381．88?1．142．26?0．952．62?1．102．28?0．683．12?0．86*3．30?1．05*4．55?1．79*2．58?1．34*2．07?1．08α-SMA1?02．48?0．643．05?0．853．02?1．322．79?0．832．32?0．333．15?1．103．44?1．41*3．31?1．27*4．06?2．12*3．90?1．41* Collagen I1?01．21?0．230．95?0．081．07?0．171．43?0．171．39?0．061．37?0．151．71?0．21*2．08?0．74*2．19?0．27*1．98?0．11* Collagen III1?01．84?0．741．94?1．021．97?1．142．27?1．181．75?0．492．42?0．892．73?0．97*3．04?1．15*2．88?0．34*2．44?0．37* *P＜0．05vs0min．

2Y-27632对TGF-β

1

诱导ROCK、p-MBS、SRF、

α-SMA、I型胶原和III型胶原蛋白在细胞中表达的影响

Western blotting法结果显示（图3、表2），经

TGF-β

1

诱导6h、12h和24h后，ROCK表达增加，分别是相应时点对照组的1．98倍、1．46倍和1．72倍。给予Y-27632预处理后，ROCK表达显著下降，在6h、12h和24h各时点分别是TGF-β1诱导组的48.48%、54．79%和50．62%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

TGF-β

1

诱导6h、12h和24h后，p-MBS/t-MBS 表达增加，分别是相应时点对照组的2.25、2.78和1.95倍。给予Y-27632预处理后，p-MBS/t-MBS表达显著下降，在6h、12h和24h各时点分别是TGF-β1诱导组的64.00%、45.02%和54.86%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

TGF-β

1

诱导6h、12h和24h后，SRF表达增加，分别是相应时点对照组的2.01、2.76和2.62倍。给予Y-27632预处理后，SRF表达显著下降，在6h、

12h和24h各时点分别是TGF-β

1

诱导组的60.70%、43.75%和33.20%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

TGF-β

1

诱导6h、12h和24h后，α-SMA表达增加分别是相应时点对照组的1.48倍、1.53倍和2.13倍。给予Y-27632预处理后，α-SMA表达下降，在6

h、12h和24h各时点分别是TGF-β

1

诱导组的43.24%、59.18%和45.83%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

经TGF-β1诱导6h、12h和24h后，I型胶原表达逐渐增加，分别是相应时点对照组的1.83倍、1.64倍和1.89倍。给予Y-27632预处理后，I型胶原表达下降，在6h、12h和24h3个时点分别是

TGF-β

1

诱导组的43.17%、56.29%和51.89%，差异有统计学意义（P＜0.05）。经TGF-β1诱导6h、12h 和24h后，III型胶原表达增加，分别是对照组的1.89倍、1.57倍和2.20倍。给予Y-27632预处理后，III型胶原表达下降，在6h、12h和24h各时点分别是TGF-β1诱导组的60.32%、41.03%和43.96%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

讨论

矽（尘）肺是由于长期吸入含二氧化硅（SiO2）粉尘而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主要表现的疾病，其主要的病理学变化为肺间质细胞增殖和细胞外基质（包括胶原蛋白）过多沉积导致肺的纤维化。在矽（尘）肺形成过程中，SiO2粉尘刺激肺泡巨噬细胞产生的各种细胞因子和活性物质是矽肺纤维化发生的重要因素，其中TGF-β1是目前公认的最为重要的致矽肺纤维化的因子之一［1-3］。体外研究也证实，采用SiO2刺激巨噬细胞或提取的灌尘老鼠肺泡灌洗液中的巨噬细胞，其培养上清TGF-β1含量明显增加，能够显著诱导成纤维细胞的增殖和胶原合成，以及促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化［4-5］。而肌成纤维细胞其收缩、迁移和合成细胞外基质的能力与功能远远大于肺间质的成纤维细胞，是器官纤维化形成过程中产生过量细胞外基质的最主要和最重要的细胞，在器官纤维化的发生与发展过程中具有重要意义［2-4］。Wang等［7］报道，在大鼠单侧输尿管结扎致肾小管间质纤维化模型中，肾组织中TGF-β1、单核细胞趋化蛋白1、核因子κB和α-SMA的表达均较对照组（没有进行输尿管结扎）明显升高，肾小管间质内胶原的分布增多，胶原沉积增加。Peng 等［8］应用TGF-β1诱导刺激人胚胎心脏成纤维细胞24h后，细胞胞浆内出现较明显的α-SMA和胚胎型平滑肌肌球蛋白表达阳性的肌丝结构，其蛋白表达水平明显增加，同时细胞合成、分泌的胶原含量升高。Lomas等［9］最近报道在人特发性肺纤维化患者肺组织纤维化聚集区，TGF-β1表达明显升高，而α-SMA和I型胶原表达也明显增加。认为在特发性肺纤维化形成过程中，TGF-β1刺激间质细胞的分化和

·

1671

·

Figure3．Effects of Y-27632on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibro-

blasts induced by TGF-β

1．C：control；T：TGF-β

1

；Y：TGF-β

1

+Y-27632．

图3Y-27632对TGF-β

1

诱导的大鼠肺成纤维细胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原表达的影响

表2Y-27632对TGF-β

1

诱导的大鼠肺成纤维细胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型胶原和III型胶原蛋白表达的影响

Table2．Effects of Y-27632on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts in-

duced by TGF-β

1

（Mean?SD．n=3）

Group

ROCK p-MBS/t-MBS SRFα-SMA

6h12h24h6h12h24h6h12h24h6h12h24h

Control1?01．01?0．170．93?0．341?00．98?0．111．16?0．271?00．75?0．210．93?0．301?00．96?0．140．90?0．12

TGF-β

11．98?0．54*1．46?0．38*1．60?0．47*2．25?0．06*2．71?0．51*2．26?0．51*2．01?0．50*2．40?0．76*2．44?0．61*1．48?0．21*1．47?0．36*1．92?0．26*

TGF-β

1

+

Y-27632

0．96?0．12#0．80?0．09#0．81?0．27#1．45?0．27#1．23?0．31#1．24?0．35#1．22?0．20#1．05?0．14#0．81?0．24#0．64?0．45#0．87?0．02#0．88?0．09#

*P＜0．05vs control group；#P＜0．05vs TGF-β

1

group．

胶原的合成与积聚密切相关。以往较多研究表明TGF-β

1

可以通过对Smad、细胞外信号调节激酶和蛋白激酶A等信号转导通路的调节促进靶器官间质细胞向肌成纤维细胞的分化［8，10］。然而，近年来有学者发现TGF-β1能够通过介导Rho信号转导通路的激活，调控肌成纤维细胞的分化。其可能的调节路径为，TGF-β1通过其受体介导，激活靶细胞胞浆内的Rho（也称之small GTPase），活化的Rho依次激活其下游的靶蛋白即ROCK，ROCK活化后抑制胞浆内肌动蛋白磷酸酶的活性，从而诱导了肌动蛋白轻链的磷酸化和张力纤维的聚集，促进了靶细胞α-SMA蛋白的表达和胞浆骨架蛋白的重构［6，10-13］。SRF是α-SMA上游的核转录因子，参与介导α-SMA表达的调控［10］。

本研究发现，随着TGF-β1刺激细胞时间的延长，肺成纤维细胞开始由瘦长梭形逐渐转变为宽大、多边形，细胞表型发生了较明显的转变。当诱导刺激3h时，胞体内可见明显α-SMA抗体标记的肌丝出现，并随着时间延长平行与交叉排列的肌丝成分越来越多，当诱导刺激24h时，几乎所有细胞胞体内均有肌丝表达，即细胞均转化为了肌成纤维细胞。

与对照组相比较，TGF-β1刺激后的细胞中RhoA/ROCK/p-MBS蛋白表达量显著增多，在诱导刺激6h左右，RhoA/ROCK相关信号转导蛋白表达量就明显上调。作为其下游效应因子的核转录因子SRF蛋白的表达量也明显增多，在12h左右SRF蛋白表达量达到峰值。同时，细胞中α-SMA蛋白的表达量随时间增加逐渐增多，I型和III型胶原蛋白的

·

2671

·

表达量也明显增加，均在24h达到峰值。这一过程似乎提示了TGF-β1诱导激活ROCK通路后，随后活化SRF，并进一步调控α-SMA的表达，刺激诱导了肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，进而促进I型和III型胶原蛋白的合成与表达。

当给予ROCK通路特异性阻滞剂Y-27632干预后，ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA以及I型和III型胶原蛋白的表达在各相应时点均明显减少。这提示ROCK通路特异性抑制剂Y-27632可以有效抑制这一过程，也从另一个方面证实了TGF-β1介导的ROCK信号转导通路的激活对于调控肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化、促进胶原蛋白合成、进而促进（矽）肺纤维化的形成具有重要的意义。

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