脂质体制备方法

微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二

微脂体(又称脂质体)

微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer)

所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。

微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类：

(1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，

直接水合后，即形成MLV，体积通常较为庞大，脂质含量较高。MLV 的脂双层数，一般在五层以上；小于五层的MLV 又称为oligo-lamellar liposomes 或paucilamellar vesicle。

(2) Large Unilamellar Vesicle ( LUV) 则是单层脂双层所构成的微脂体，一般指1000 nm 等级(250-2500 nm 或更大)的微脂体，动物细胞便是一种LU V。

(3) Intermediate-sized Unilamellar Vesicle (IUV) 也是单层脂双层所构成的微脂体，一般指100 nm 等级(25-250 nm)的微脂体。不过，目前一般文献已经很少使用IUV，而是将它并入SUV 中。

(4) Small Unilamellar Vesicle (SUV）是单层脂双层所构成的小微脂体，早期的分类指特定磷酸脂所能够成的最小微脂体(一般以超音波震荡制成)。如egg PC 以生理食盐水(normal saline) 水合的SUV 是15 nm；DPPC 则是25 nm。

制备微脂体最传统的方法是薄膜摇振法。如今已经发展出非常多种制备微脂体的方法，包括：

1.) 薄膜摇振法（Thin film method; Hand-shaking method）：又称做Ban gham’s method，将脂质以有机溶剂如氯仿（chloroform）、甲醇（methanol）及乙醇（ethanol）等溶解，均匀混合后，利用旋转真空干燥机(rotary evapor ator) 使圆底瓶内的溶剂挥发之后，即可在瓶壁上形成均匀的脂质膜，在临界温度以上的温度条件下，将欲包覆物质的水溶液和脂质膜混合，用手左右摇动，将瓶壁上的脂质膜振下来，脂质在水溶液中即会自动形成MLV。

2.) 冷冻-再解冻(freez-thaw)、均质(homogenization)及超音波震荡法（soni cation method）：利用微脂体破裂后会再自行密合的特性，以机械性的力量均质或超音波震荡的方式，或者多次冷冻、再解冻的方式，造成微脂体的破裂及重组再密合，最后可形成大小较均匀的单层微脂体。

3.) 反相蒸发法（Reverse phase evaporation method）：以有机溶剂溶解高浓度的脂质，快速混入对于脂质量而言体积极少的药品水溶液，将两者混合均匀后再以旋转真空干燥机使有机溶剂挥发，形成包覆率较高的微脂体。这种方法适合用来包覆较为稀少或是较珍贵的药品及蛋白质。

4.) 有机溶剂注射法(solvent injection)和清洁剂透析法(detergent dialysi s)：利用有机溶剂和清洁剂溶解脂质，与准备包覆的水溶液混合形成微脂体后，以透析法除去有机溶剂和清洁剂。

5.) 滤膜挤出法（Extrusion ）：可将上述方法制成的微脂体，改变成所需粒径大小的单层微脂体。MLV或LUV置于挤压器(extruder)中，加热到临界温度以上的温度，以氮气或氩气加压，即能将粒径较大的微脂体挤成接近滤膜孔径大小的微脂体。重复挤压数次后，即可制造出所需粒径大小且粒径分布范围相当窄的微脂体。利用这种方法制成的微脂体可将粒径大小控制到一百奈米以下。

微脂粒在体内之举止，依其本身的型态、粒径、脂质组成、表面电荷及服用者的生理状况、投药部位等而有很大差异。微脂粒于静脉注射后，在血液中至少与两类血浆蛋白发生作用，1）所谓调理素（opsonins)可附着于微脂粒表面，促使其被RES之吞食细胞噬食。2）高密度脂蛋白（HDL）袭击微脂粒，藉phosph atidylcholine transferase活性蛋白之助，抽掉微脂粒上之磷脂分子，使微脂粒破洞或崩溃，内容物漏出。此二作用皆导致微脂粒在体内之半减期缩短。目前已研究出几种改善之道以延长微脂粒在血液循环中之半减期，此种微脂粒称为长命微脂粒（stealth liposomes）。

微脂粒的表面可设法接上抗体或受质，在体内发挥指向功能。针对目标细胞膜上的特殊抗原或受体，将对应抗体或受质分子接在微脂粒上，可使绝大部份的微脂粒聚集至目标细胞。

微脂粒与细胞作用的机制有数种：1）膜组成交换（intermembrane transf er）：即微脂粒膜的组成与细胞膜的组成中有一部份互相交换；2）吸着（ads orption）：微脂粒附着于细胞膜；3）膜融合（fusion）：微脂粒与细胞膜融合，将包容物送进细胞内；4）吞食（phagocytosis, endocytosis）：微脂粒被细胞吞食。欲使微脂粒依期望之机制与细胞作用，则要设计微脂粒。

阳离子脂质体(cationic liposome) 介导转染核酸进入真核细胞的方法是从8 0 年代中期发展起来的一种最具创新性的、高效的转染(transfection) 技术。阳性脂质体(cationic liposome) ,又称阳离子脂质体、正电荷脂质体(positively ch arged liposome) ,是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。它可作为荷负电物质的传递载体,特别适用于蛋白质、多肽和寡核苷酸类物质、脱氧核糖核酸(DNA) 、

核糖核酸(RNA) 等,所以在基因治疗方面有独特应用,近年来，成为在体外研究基因功能和基因表达调控机理的重要手段。阳性脂质体介导的转染法可将外源基因导入任意种类哺乳动物的原代细胞或连续培养的细胞，在贴壁培养体系和悬浮培养体系中均能应用，并且能得到顺时表达（transient expression）和稳定表达（stable expression）的细胞株。

1．阳性脂质体的组成

绝大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成。中性磷脂和阳性成分都是具有亲水和疏水两种基团，其分子间相互间隔定向排列形成类脂双分子层。其中,中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性脂质的细胞渗透功能。阳性成分是具有不同化学结构的两性分子,多为双链季铵盐型表面活性剂,为整个脂质体提供正电荷，有很强的细胞膜去稳定化作用。目前，使用最广泛的阳性成分有以N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、3β-[ N-( Nˊ, Nˊ-二甲基胺乙基) 胺基甲酰基]胆固醇(DC-Ch ol)、2,3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵(DO SPA) 、1 ,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(DOTAP)等，具有体外稳定性好，体内可被生物降解的特点，但具有一定的细胞毒性。

2．阳性脂质体介导基因转染的作用机制

阳性脂质体介导的基因转染过程中，阳性脂质体的重要性体现在三个方面：（1）与DNA形成脂质体-DNA复合物（2）与细胞膜的作用（3）将DNA释放到细胞中。

2.1 阳性脂质体-DNA复合物（Lipoplex）的形成

最初人们认为，阳性脂质体的表面带正电荷，能被核酸中带负电荷的磷酸根所吸附，这样通过阳性脂质体的介导，可以把核酸物质结合到细胞膜上。Gershon

于1993年使用电镜技术,研究了复合物的形成和结构特征。他认为,阳性脂质体最初结合到DNA分子上,在核酸分子上形成成束的囊泡聚合物。当聚合达到一定程度时,DNA 诱导的脂质体膜融合和脂质体诱导的DNA断裂同时发生,断裂后的DNA分子被包封于重新形成的脂质体中。后来，Stefan Huebner等于1999年系统地阐述了复合物的结构特征及形成机理。他指出，复合物的形成与脂质体／DNA的电荷比例有密切联系。复合物有三种形式：（1）由DNA包裹的单层囊

泡（2）由单层囊泡组成的寡聚复合物（3）多层囊泡聚合物。并且他提出“脂质体滚动”：当一个由DNA包裹的单层囊泡被另一个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂，沿着“模板”囊泡“滚动”，依此类推，就形成了多层囊泡聚合物，这就解释了复合物缺口形成的原因。目前，这一观点已逐渐为广大研究者所认可。

2.2 细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取

最初的研究指出，最初的研究指出,对于带负电荷的核酸物质(DNA、RNA和寡核苷酸) ,主要是通过胞饮作用(endocytosis)进入靶细胞的。通过细胞内吞作用(endocytosis) ,将复合物包封于有衣小泡(coated vesicle) 内。进入细胞质后,有衣小泡形成内吞小泡(endosome),与其它细胞内囊泡融合,又将内吞物转送到溶

酶体（lysome）内,实现内吞作用介导的脂质体与细胞的融合。还有一种假说是融合理论：阳性脂质体与细胞结合后,脂质体膜和细胞膜表面重合部分发生融合,将DNA释放到胞浆中。Wrobel等曾以肝癌细胞G2(Hep G2)和中国仓鼠卵巢(C HO) 细胞为靶细胞,研究了脂质体与细胞的融合过程, 证明内吞作用是融合的关键。在三磷酸腺苷(ATP) 耗竭剂和高渗介质等抑制内吞作用的物质存在下,脂质体只能与细胞表面结合,不能实现内吞作用，而此时转染效率较无抑制剂的对照组相比低了许多。Leventis等发现阳离子脂质体与细胞融合活性和转染率不一致,证明融合机制不是其转运的主要渠道。所以，人们认为细胞对阳性脂质体-DNA 复合物的摄取主要通过内吞作用来实现的。

2.3 阳性脂质体-DNA复合物（Lipoplex）在细胞内释放DNA的机制

Hopkins等指出阳离脂质体-DNA 复合物进入细胞内与溶酶体(lysome) 膜融合，主要分布于核周高度有序的管状结构中,如核内体(endosome) 中,含有阳离子脂质体–DNA 复合物的核内体膜极不稳定,可以释放出复合物。Farhood等在研究中也发现溶菌酶试剂氯醛的存在会抑制DNA向细胞的传递过程,因此,认为脂质体的主要功能是使内吞小泡去稳定化,将DNA释放到细胞中。

3 影响阳性脂质体介导的基因转染效率的因素

3.1 阳性脂质体与DNA的电荷比例

Huebner等应用冷冻蚀刻电镜技术（cryo and freeze-fracture electronic micr oscopy）发现，阳性脂质体与DNA的电荷比例决定了复合物的结构和大小，电

荷比例有0.2的差距，其复合物的结构、大小都有很大差异。不加DNA 的情况下，脂质体是单层囊泡（unilamellar vesicles）形式存在，其直径为65nm（±1 8nm）。当DNA的比例较少时，复合物多以多层囊泡聚合物（multilamellar co mplex）形式存在，其直径较单层囊泡要大的多。当DNA的比例较高时，复合物多以DNA包被的单层囊泡（DNA-coated,and fused DNA-coated,unilamella r vesicles）结构存在，也有少量寡聚复合物（cluster of DNA-coated vesicle），其大小较多层囊泡聚合物小的多。不同类型的细胞其吸收大小各异颗粒的能力也不尽相同。根据具体情况准备适宜的脂质体-DNA复合物对于转染效率是很重要的。

3.2 细胞的状态

维持转染细胞的生长是重要的，但更重要的是细胞要处于健康旺盛状态。常规的细胞操作是包括分瓶的传代（passage），每次传代以1：3到1：5的比例分瓶，具体的传代间隔时间以细胞的生长周期来决定。同时转染时机的把握也很重要．一般，细胞铺满瓶底50％～70％为宜，注意在转染时培养瓶内细胞不能长满。

3.3 血清

血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低, 双

分子层堆积特性改变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上, 使脂质体膜的通透性

增加, 最终破裂。其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白也可引起脂质体膜的不稳定。DNA -脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的, 如果部分转染要在一定百分比的血清浓度下才能完成, 但脂质体-DNA 复合物仍

必须在无血清的条件下形成。若在脂质体-DNA 复合物形成过程中血清存在的话,将会降低转染的表达活力, 这可能是由于复合物同带负电荷的血清蛋白结合,

电荷被中和的缘故, 但当脂质体-DNA 复合一旦形成, 影响就不那么明显。

3.4 载体

在实施转染的过程中, 选择适合的转染载体如同选择恰当的细胞株和培养条件一样重要。载体包括质粒、通常认为的嵌合体、杂交细菌或杂交细胞, 有时也包括病毒序列。完成转染过程后, 一些基因顺序允许载体在细菌(如普通的大肠杆菌) 中复制以增殖足够量的DNA; 另外的一些序列则是在真核细胞中克隆化

的转基因表达所必需的。一类载体能在真核细胞内成指数倍复制, 最终导致细胞死亡, 它们只能用于暂时性的表达; 另一类不在真核细胞内复制的载体可同时应用于暂时的和稳定的表达。使用自发性复制的质粒, 在真核细胞中允许非指数复制, 这就可能不通过整合作用而得到稳定的表达。

3.5 阳性脂质体的阳性成分

许多研究表明,阳性脂质体的阳性成分对于基因的转染率有很大影响。Claire 等以几种不同的阳性脂质体介导质粒DNA pSV-CAT 转染3T3 脂肪细胞,以氯霉素乙酰基转移酶(CAT) 活性代表转染率,结果表明转染率依次为:LipofectAMI NE > DOGS > DOTAP >Lipofectin。Cheng 等以阳性脂质体-DNA-转铁蛋白介导β-半乳糖苷酶基因转染人宫颈癌上皮细胞(Hela) ,转染相对有效性为DC-C hol > LipofectAMINE。由Pinnaduwage 等合成的DTAB , TTAB ,CTAB 介导的基因转染率低于Lipofectin。

4. 阳性脂质体介导转染法的优点及应用前景

阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体,具有下列优点: ①可防止核酸被体内物质降解,可将其特异性传递到靶细胞中。②无毒、无免疫原性,具有生物惰性,可生物降解。③易于制备,使用方便,可将大的DNA 片断转运到细胞中。④基因转染率高,离体细胞可以瞬间表达外源基因。目前，阳性脂质体介导转染技术在基因治疗方面取得巨大的成果，随着转染机制的阐明，这一全新的技术在今后的基因治疗领域中将发挥其无穷的潜力。

制作方法一二：

(1)Lipids and lipid vesicles

Egg-phosphatidyl-choline (egg-PC), dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPP C), dimyristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC) and cholesterol (Chol) were o btained from Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) and stored in chlor oform. All lipids were used without further purification. High graded mica was purchased from Ted Pella, Inc. (Redding, CA). Pure water was obta ined with a MilliQ system (Millipore, Beford, MA). One of methods for pr eparing supported bilayers is by fusion of vesicles. Large unilamellar vesi

cles (LUV) were prepared by the freeze-thaw extrusion method. The lipid s, dissolved in choloform, were dried to a thin film under a stream of nit rogen, and were dried overnight in vacuum for the solvent to completely evaporate. The lipid film was then hydrated and mixed by vortex. After six freeze-thaw cycles the suspension was passed through the lores of a polycarbonated membrane (200nm, Avanti Polar Lipids Inc.) with the aid of a lipid extruder (Avanti Polar Lipids Inc.). Vesicle solutions were mad e in aqueous solution and then diluted to the desired concentration in a 10mM MgCl2 solution.

(2)ILS Method

Another method for preparing supported bilayers in the experiment is by depositing two monolayers onto mica substrate. The first monolayer is de posited by inverse-LS method 6. Mica, which have a hydrophilic surface, was submerged just below the subphase surface before the monolayer was spread. Monolayer was then spread and compressed to the desired surface pressure. The subphase was aspirated out of the trough to slo wly lower the subphase level. Eventually the subphase level reached the mica's edge, causing the first monolayer with same domain patterns as on subphase deposited on mica. With the first monolayer on mica, the s urface was then hydrophobic. LS method, which required a hydrophobic surface, was used to deposit the second monolayer on mica. The final b ilayer are composited by two monolayers with its' own domain patterns, which are not necessarily totally coincided. The mica was wetted all the time during deposition. After depositing the second monolayer, the mica was still immersed under subphase, a Teflon receiver was used to hold the mica with water, and flipped above subphase in order to prevent rea rrangement on bilayers.