脂质体的制备概要
实验十五
脂质体的制备
一实验目的
1.了解脂质体（liposome）在细胞
工程技术中的应用及其制备方法。
2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法
和冻融法三种不同的方法制备脂
质体的方法并了解该技术在细胞
工程中的应用。
二实验原理
脂质体（liposome）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰
冻干燥法和冻融法等。制备方法
不同，所得脂质体结构、大小不
同，性质和用途也就不同（表15-1）。
种类制备方法大小(m) 特性
多层大脂质体(MLV) 乙醚蒸发法、醇醚水
法、振荡法、液相快
速混合振荡法
0.1~50 易制备，包被物释放
速度慢
单层小脂质体(SUV) 直接超声波法、溶剂
超声波法、乙醚注射
法
0.02~0.05 体积小，适合包被离
子、小分子药物等
单层大脂质体(LUV) 递相蒸发法、去污剂
（胆酸纳等）透析法、
冰冻干燥法
0.05~0.5 适合包被蛋白质、
RNA、DNA片段、
大分子药物及细胞融
合
单层巨大脂质体(GUV) 冻融法5~30 适合包被蛋白质、
RNA、DNA片段，
除菌处理较难
本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥
法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。
三实验用品
1.器材
超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光
分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。
2.试剂
１）磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷
脂，57.2mg胆固醇，溶于1ml氯仿。
２）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于
100ml Tris缓冲液。
３）Tris 缓冲液：称取Tris 0.12g，EDTA
0.288mg，溶于80ml去离子水中，用0.1 mol/L
盐酸调Ph7.2，再加水至100ml。
4)2%叠氮钠液。
5)透析液：称取EDTA2.88mg，加入
143ml荧光液中，再加无离子水至1000ml，同时加入10ml叠氮钠液。
6)10m mol/L氯化钴液。
四实验步骤
1.超声波法制备脂质体
取磷脂液330μl于2.0ml安瓿瓶中，真空干燥20min，再加入荧光液530μl及液
530μl，充氮气、封口、漩涡混合器混
匀，与超声波清洗机中处理处理10min
（电流200~300mA），所得液体即为单层
小体积脂质体（SUV）。
直径分配率计算：取16μl适当稀释的脂质体液（一般稀释100倍）加在载玻片上，盖上盖玻片，并用凡士林封口，用目微尺观测5个视野里的脂质体直径，记录，按下式计算直径分配率D。
D=[X1(0~0.01)+X2(0.01~0.02)×2+X3(0.02~0.03)×3+…]/N
其中X1为5个视野里0~0.01μm直径脂质体数的平均值，N为视野数5。
包被率计算：取15μl脂质体液稀释液于2985μl Tris液中，在荧光分光光度计上测量荧光强度(A)；加入12μl CoCl2液，静置5min，使脂质体外的荧光猝灭，测量膜内荧光强度值（B）；加入150μl 10%Triton X-100破膜液，破膜5min，再测量荧光强度(C)。
包被率=(B-C)/(A-C)
其中A为总荧光强度，B为脂质体荧光强度，C为本底荧光强度。
2.冻融法制备脂质体
取磷脂液330μl于安瓿瓶中，真空干燥20min，加入Tris液530μl，充氮气，封口，漩涡均匀，超声波处理5min（电流200~300mA），打开瓶口，加入荧光液140μl，氯化钾112mg，漩涡均匀，然后置于干冰-丙酮浴中冷冻1min。取出，室温融解，漩涡均匀。冻融过程重复两次。完成后
将脂质体装入透析袋中，在磁力搅拌下对透析
液透析2h，换透析液两次（用于与原生质体融
合实验时，透析时间与透析配方可与原生质体
培养基适当配合），即得单层巨大脂质体（GUV）。
直径分配率计算及包被率测定同超声波法。记录测定结果。
3.冰冻干燥法制备脂质体
取磷脂液330μl于安瓿瓶中，真空干燥20min，加入Tris液530μl，充氮气，封口，涡旋均匀，超声波处理（电流200~300mA）5min，打开瓶口，加入荧光液140μl，涡旋均匀。冰冻干燥10h，取出后加无离子水1ml，涡旋均匀，室温静置1h，超声波处理1min，即得单层大脂质体(LUV)。如需更大体积脂质体可重复冻干过程两次。
直径分配率及包被率测定同超声波法，记录测定结果。
4.均一脂质体的制备
冻融法和冰冻干燥法所制备的脂质体皆可作为DNA、蛋白质或其他较大分子的载体，用于药物运载及与原生质体的融合等。一般来说，作为载体的脂质体在实用前都须经均一化处理。
将琼脂糖凝胶4B柱（1×20cm）用Tris液品平衡3倍柱体积（约47ml），流速0.5ml/min，平衡完全后，取脂质体液0.5ml常规上样，Tris液洗脱，洗脱速度0.3ml/min，用核算蛋白检测仪检测洗脱液A280，收集第一峰，即为较均一的脂质体。
以A280为纵坐标，洗脱液体积为横坐标，画出脂质体洗脱曲线。
五思考题
1.脂质体的结构及用途如何？
2.简述制备脂质体的基本步骤。
3.比较超声波法、冰冻干燥法所制备的脂质
体的体积，并解释其原因。
脂质体制备方法
微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，
实验十五 脂质体的制备
实验十五 脂质体的制备 一、实验目的 1. 掌握注入法制备脂质体的工艺。 2. 掌握脂质体包封率的测定方法。 二、实验原理 60年代初Banghan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜组成且被水相隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。197l年Ryman等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包囊在脂质体中。近年来脂质体作为药物载体在传递给药系统中的研究有了迅速的发展。 脂质体系一种人工细胞膜，它具有封闭的球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用。特别适于作为抗癌药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。 脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，并进一步形成椭圆形或球状结构——脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺，磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 脂质体可分为三类：小单室(层)脂质体，粒径在20～50nm，凡经超声波处理的脂质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体；多室(层)脂质休，粒径约在400～1000nm；大单室脂质，粒径约为200～1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多属这—类。 脂质体包封率的测定 包封率的定义可用下式表示： 包封率％ =（W总 - W游离）/ W总 x 100 式中W总——脂质体混悬液中总的药物量。W游离——未包入脂质体中的药物量。 影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组成比例，制备方法及介质的离子强度等。 包封率的测定方法有凝胶过滤法（常用凝胶为Sephadex G50、Gl00或Sephrous4B、6B）、超速离心法、透析法、超滤膜过滤法等，根据条件加以选择。 脂质体的制法有多种，可按药物性质或需要进行选择。薄膜分散法是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理，可得到小单室脂质体。此法特点是操作简便，但包封率较低。注入法，根据所用溶解磷脂质的溶剂，可分为乙醚注入法和乙醇注入法。乙醚注入法是将磷脂，胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴入50～65°C水性溶液中，蒸去乙醚，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10％乙醇。反相蒸发法，是制备大单室脂质体的方法，此法包封率高。冷冻千燥法，适于在水中不稳定的药物制备脂质体。熔融法，此法适于制备多相脂质体，制得的脂质体稳定，可加热灭菌。本实验乙醚注入法制备安定脂质体，用薄膜分散法制备钙黄绿素脂质体。
脂质体及其制备方法的选择
脂质体及其制备方法的选择 1.脂质体概述 1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为４纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。此两位学者曾获得过诺贝尔奖提名。 某些磷脂分散在过量的水中形成了脂质体，该脂分子本身排成双分子层，在磷脂的主要相变温度(Tm)以上，瞬间形成泡囊，且泡囊包围水液，根据磷脂种类及制备时所用温度，双分子层可以是凝胶或液晶状态。在凝胶态时磷脂烃链是一种有规律的结构，在液态时烃链是无规律的，每一种用来制备脂质体的纯磷脂由凝胶状态过渡到液晶状态时均具有特征的相变温度。这种相变温度(Tin)是根据磷脂性质而变(见下表)，它可在-20～+90℃之间变化，双分子层的不同成分混合物可引起相变温度的变化或相变完全消失，当双分子层通过相变温度时，被封闭的水溶性标示物的漏出量增加。 脂质体的相变行为决定了脂质体的通透性、融合、聚集及蛋白结合能力，所有这些都明显影响脂质体的稳定性和它们在生物体系中的行为。
脂质体根据其脂质膜的层数和腔室的数量，可以分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体，单层脂质体。不同类型的脂质体其结构特点各不相同，见下图表。 1971年，英国Rymen等人开始将脂质体用作药物载体。所谓载体，可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被巨嗜细胞吞噬后载体被酶类分解而释放药物，从而发挥作用。它具有类细胞结构，进入动物体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，也是目前国际上最热门的制药技术。至于药物在脂质体中的负载定位，其取决于所载药物的性质，见下图。
脂质体的制备
实验十五 脂质体的制备
一实验目的 1.了解脂质体（liposome）在细胞 工程技术中的应用及其制备方法。 2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法 和冻融法三种不同的方法制备脂 质体的方法并了解该技术在细胞 工程中的应用。
二实验原理 脂质体（liposome）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰 冻干燥法和冻融法等。制备方法 不同，所得脂质体结构、大小不 同，性质和用途也就不同（表15-1）。
种类制备方法大小(m)特性 多层大脂质体(MLV)乙醚蒸发法、醇醚水 法、振荡法、液相快 速混合振荡法 0.1~50易制备，包被物释放 速度慢 单层小脂质体(SUV)直接超声波法、溶剂 超声波法、乙醚注射 法 0.02~0.05体积小，适合包被离 子、小分子药物等 单层大脂质体(LUV)递相蒸发法、去污剂 （胆酸纳等）透析法、 冰冻干燥法 0.05~0.5 适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段、 大分子药物及细胞融 合 单层巨大脂质体(GUV)冻融法5~30适合包被蛋白质、 RNA、DNA片段， 除菌处理较难
本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥 法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。
三实验用品 1.器材 超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。 2.试剂 １）磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷 脂，57.2mg胆固醇，溶于1ml氯仿。 ２）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于 100ml Tris缓冲液。 ３）Tris 缓冲液：称取Tris 0.12g，EDTA 0.288mg，溶于80ml去离子水中，用0.1 mol/L 盐酸调Ph7.2，再加水至100ml。
实验十五 脂质体的制备.
实验十五脂质体的制备 一、实验目的 1. 掌握注入法制备脂质体的工艺。 2. 掌握脂质体包封率的测定方法。 二、实验原理 60年代初 Banghan 等发现磷脂分散在水中可形成多层囊,并证明每层囊均为双分子脂质膜组成且被水相隔开,称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。197l 年Ryman 等人提出将脂质体作为药物载体, 即将酶或药物包囊在脂质体中。近年来脂质体作为药物载体在传递给药系统中的研究有了迅速的发展。 脂质体系一种人工细胞膜, 它具有封闭的球形结构, 可使药物被保护在它的结构中, 发挥定向作用。特别适于作为抗癌药物载体,以改善药物的治疗作用,降低毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂, 如豆磷脂,卵磷脂等;合成磷脂,如二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中, 磷脂分子定向排列, 其亲水基团面向两侧的水相, 疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层, 并进一步形成椭圆形或球状结构——脂质体。常用的附加剂为胆固醇,它也是两亲性物质,与磷脂混合使用,可制备稳定的脂质体,其作用是调节双分子层流动性,减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺,磷脂酸等,这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 脂质体可分为三类:小单室(层脂质体,粒径在 20~50nm,凡经超声波处理的脂质体混悬液, 绝大部分为小单室脂质体; 多室(层脂质休, 粒径约在 400~1000nm; 大单室脂质, 粒径约为 200~1000nm,用乙醚注入法制备的脂质体多属这—类。 脂质体包封率的测定包封率的定义可用下式表示: 包封率% =(W总 - W游离 / W总 x 100
国外部分公司脂质体药物研发现状
国外部分公司脂质体药物研发现状 摘要：目的介绍国外脂质体药物的开发现状。方法综述了14 家外国公司所发展的脂质体技术平台和正在开发的脂质体药物。结果和结论目前主要有3 类脂质体药物正在被开发：化疗药物\疫苗和核酸类药物。并且国外从事脂质体药物研发的公司都有自己的专利技术。关键词：药剂学；研究进展；综述；脂质体 中图分类号：R94 文献标识码：A 自从1965 年Bangham 等人发现脂质体，近40 年已经过去了。在这40 年中，经过众多科研人员的不懈努力，脂质体领域出现了许多里程碑式的工作，如：pH 梯度法的发明，长循环脂质体的制备及主动靶向脂质体的发明等。作为一种先进的药物传递系统，脂质体的优势已经被越来越多的人所承认（这里讲的药物是一个广义的概念，既包括化学药物，也包括蛋白质类及核酸类药物）。 作者将简要介绍国外脂质体药物的研发现状。所谓脂质体药物，指的是以脂质体为载体的治疗或预防性药物。由于在国外，新药的研发工作主要由制药公司完成，所以将着重介绍国外从事脂质体药物开发的公司，它们所采用的新技术和开发的脂质体药物。 1 ALZA ALZA 是一个专门从事药物传递系统（drug delivery systems，DDSs）开发的公司[1,2]。它的主要技术平台就是隐型脂质体（STEALTH. liposomes，实际上就是长循环脂质体）技术。众所周知，尽管传统的脂质体可以提高药物的疗效，降低药物的不良反应，但是它们在体内很容易被免疫系统识别和吞噬；因此脂质体可能还没有到达靶区，就已经被机体清除掉了。采用STEALTH.技术，则可以避免这种情况。由于长循环脂质体表面覆盖着一层 PEG(polyethylene glycol)凝胶，它可以成功的逃脱免疫系统的吞噬和破坏。并且，如果长循环脂质体的粒径小于150 nm，它可以有效的穿透肿瘤区的血管，在肿瘤区富集，这样就改变了药物在体内的分布，降低了毒性。 ALZA 采用STEALTH.技术，已经成功的开发了阿霉素脂质体注射液Doxil.。Doxil.主要用于治疗复发性卵巢癌和AIDS 相关的Kaposi’s肉瘤。 2 Antigenics 目前Antigenics 正在开发两个脂质体产品[3,4]：Aroplatin. 和ATRA-IV.。ATRA-IV. （又名ATRAGEN. ）是全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid）的脂质体注射制剂。全反式维甲酸主要用于治疗急性早幼性骨髓性白血病（acute promyelocytic leukemia）, 但是它的口服制剂存在一个重要缺陷，那就是药效的持续时间太短。将其制成脂质体制剂后，药物的血药浓度增加，起效时间明显延长。现在Antigenics 受FDA 委托，正在研究用ATRA-IV. 治疗T 细胞非Hodgkin 氏淋巴瘤（T cell non-Hodgkin’s lymphoma）的可行性。Aroplatin. 是第三代铂类抗癌药物，它的结构和奥沙利铂(Oxaliplatin.) 相似。细胞实验表明， Aroplatin. 可能用于治疗对其他铂类药物（卡铂 carboplatin, 顺铂cisplatin）产生耐药性的肿瘤。用Aroplatin. 脂质体治疗结肠癌的实验正在进行中。 3 Aphios Aphios 之所以在脂质体公司中拥有一席之地[5,6]，主要是由于它发展了一种独特的脂质体
脂质体的制备方法及其研究进展
脂质体的制备方法及其研究进展 作者：穆筱梅，梁世强 【摘要】介绍了目前常用脂质体的两大类制备方法：被动载药法和主动载药法，并对其优缺点进行比较。被动载药法适于脂溶性强的药物，包封率高且不易泄露；而主动载药法适于两亲性药物。 【关键词】脂质体；被动载药；主动载药 脂质体作为药物载体具有提高药物疗效、减轻药物不良反应及靶向作用的特点。三十多年来，人们就其制备方法进行了大量的研究。脂质体是由磷脂分子在水相中通过疏水作用形成的，因此制备脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小、包封率高和稳定性高的囊泡。制备的方法不同，脂质体的粒径可从几十纳米到几微米，并且结构也不尽相同。目前，制备脂质体的方法较多，常用的有薄膜法、反相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等，这些方法一般称为被动载药法，而pH梯度法，硫酸铵梯度法一般被称为主动载药法。 1 被动载药法 脂质体常用制备方法主要有薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、超声波分散等。在制备含药脂质体时，首先将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜的方法制备含药脂质体，该法适于脂溶性强的药物，所得脂质体具有较高包封率。 1.1 薄膜分散法 此法最初由Bangham 等报道，是最原始但又是迄今为止最基本和应用最广泛的脂质体的制备方法。将磷脂和胆固醇等类脂及脂溶性药物溶于有机溶剂，然后将此溶液置于一大的圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液，充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可得到脂质体。这种方法对水溶性药物可获得较高的包封率，但是脂质体粒径在0.2～5 μm 之间，可通过超声波仪处理或者通过挤压使脂质体通过固定粒径的聚碳酸酯膜，在一定程度上降低脂质体的粒径。 1.2 超声分散法 将磷脂、胆固醇和待包封药物一起溶解于有机溶剂中，混合均匀后旋转蒸发去除有机溶剂，将剩下的溶液再经超声波处理，分离即得脂质体。超声波法可分为两种“水浴超声波法和探针超声波法”，本法是制备小脂质体的常用方法，但是超声波易引起药物的降解问题。 1.3 冷冻干燥法 脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏，且磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求。1978 年Vanleberghe 等首次报道采用冷冻干燥法提高脂质体的贮存稳定性。目前，该法已成为较有前途的改善脂质体制剂长期稳定性的方法之一。 脂质体冷冻干燥包括预冻、初步干燥及二次干燥 3 个过程。冻干脂质体可直接作为固体剂型，如喷雾剂使用，也可用水或其它溶剂化重建成脂质体混悬液使用，但预冻、干燥和复水等过程均不利于脂质体结构和功能的稳定。如在冻干前加入适宜的冻干保护剂，采用适当的工艺，则可大大减轻甚至消除冻干过程对脂质体的破坏，复水后脂质体的形态、粒径及包封率等均无显著变化。单糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物质都可以用做脂质体冻干保护剂，其中二糖是研究最多也是最有效的，常用的有海藻糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖。本法适于热敏型药物前体脂质体的制备，但成本较高。陈建明等［1］以大豆磷脂为膜材，以甘露醇为冻干保护剂，采用冻干法制备了维生素A前体脂质体，复水化后平均粒径为0.615 1 μm ，包封率98.5%。林中方等［2］采用冻干法制备了鬼臼毒素体脂质体，复水化后平均粒径为 1.451 μm ，包封率72.3%，但是这种方法仍然存在着不足之处，例如脂质体复水化后粒径分布不够均匀。 1.4 冻融法 此法首先制备包封有药物的脂质体，然后冷冻。在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体。何文等［3］分别用反相蒸发法、乳化法和冻融法制备了甲氧沙林脂质体。通过研究发现，冻融法制备的脂质体的包封率最高，但是粒径最大。反复冻融可以提高脂质体的包封率，王健松［4］
脂质体的制备
脂质体的制备及检测 一.目的要求 1.掌握注入法制备脂质体的工艺。 2.掌握脂质体包封率的测定方法。 二.实验原理 1. 60年代初，Begkan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜且被水隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。1971年Rymen 等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包裹在脂质体中。 2. 脂质体系一种人工细胞膜，它具有洋葱似的封闭球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用，特别适于作为抗癌药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等，合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，形成椭圆形或球状结构一—脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。 3. 脂质体载药系统的优势： 1.被动靶向：脂质体进人体内可被巨噬细胞作为外界异物而吞噬，主要被单核巨噬细胞系统的巨噬细胞所吞噬而摄取，形成肝、脾等网状内皮系统的被动靶向性。 2.缓释作用：将药物包封成脂质体，可减少肾排泄和代谢，延长药物在血液中的滞留时间，使药物在体内缓慢释放，从而延长了药物的作用时间。 3.降低药物毒性：药物被脂质体包封后，有效地在肝、脾和骨髓等单核巨噬细胞较丰富的器官中浓集，对心、肾有毒性的药物或对正常细胞有毒性的抗癌药包封脂质体后，可明显降低药物的毒性。 4.提高稳定性：一些不稳定的药物被脂质体包封后，可受到脂质体双层膜的保护。 4. 常用的脂质体制备方法： 注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法。 脂质体作为药物载体的应用： 1、抗肿瘤药物载体：
脂质体制备方法
2 脂质体的制备方法 2.1 薄膜蒸发法该方法是将脂质及芯材（脂溶性药物）溶于有机溶剂，然后将此溶液置于大圆底烧瓶中，再旋转减压蒸干，磷脂在烧瓶内壁上会形成一层很薄的膜，然后加入一定量的缓冲溶液（生理盐水），充分振荡烧瓶使脂质膜水化脱落，即可制得脂质体。尽管薄膜分散法是使用最广泛的方法，由于这种方法比较原始，所以尚存在较多缺点。用该方法制备得到的脂质体的粒径较大且不均匀，为了使其粒径更小、更均匀，可通过超声波仪处理，在一定程度上降低脂质体的粒径，从而提高包封率。如采用此法制备得到的细辛脑脂质体的包封率达54. 1%[5]。 2.2 超声波法 MLVs的混悬液经超声波处理，再通过 Sepharose 2B或4B柱色谱仪可去除较大的脂质体和 MLVs 。常用的方法有探针型和水浴型。小量脂质悬液（高浓度脂质或黏性水溶液）需要高能 量时用探针型。水浴型更适于大量的稀释脂质。郑宁等[6]采用薄膜 -超声分散法制备依托泊苷脂质体，按均匀设计的最优组合制备脂质体的平均包封率为（61.58±0.83）% ，粒径均小于2卩m,体外释药达到了长效缓释的作用，60Co灭菌后脂质体较稳定。李维凤等⑺以薄 膜-超声法和乙醚注入法制备硝苯地平脂质体，结果表明薄膜蒸发法和超声法综合使用，所得脂质体粒径均匀,粒度小,且多为单室。 2.3复乳法（二次乳化法）这种方法是先将脂质溶于有机溶剂,加入待包封芯材的溶液,乳化得到W/O 初乳,其 次将初乳加入到 10 倍体积的水溶液中混合,进一步乳化得到 W/O/W 乳液,然后在一定温度下去除有机溶剂即可得到脂质体,其包封率变化较大,一般为20%-80% 。通过研究发现, 在第二步乳化过程和有机溶剂的去除过程中, 对脂质体的粒径有较大影响的因素是温度, 较 低的温度有利于减小脂质体的粒径。姚瑶等[8]采用二次乳化法制备的酪丝亮肽多囊脂质体, 不仅稳定性好，80%的粒径分布在 20-30卩m，且包封率为 92. 43%。 2.4反相蒸发法（逆相蒸发法）反相蒸发法最初由 Szoka 和 Papahadjopoulos 于 1978 年提出, 这 种方法适用于脂质成分中磷脂占有较大的比例, 且芯材中水溶性成分较多的情况。一般的制备方法是将脂质等膜材料溶于有机溶剂中,加入芯材药物的水溶液经过短时超声振荡形成稳定的W /O 乳液后,减 压蒸发除掉有机溶剂,形成所谓“反相胶团” ,在达到胶态后,滴加缓冲液,旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落,然后在减压下继续蒸发,制得水性混悬液, 再除去未包入的芯材,即得到 单层脂质体。因这种方法可包裹较大的水容积, 所以一般适用于包封水溶性药物、大分子生物活性物质等的情况。李淑梅等[9]采用逆向蒸发法制备黄芪多糖脂质体,操作简单可行,包 封率为 44. 32%。 2.5 注入法将脂质和芯材溶于水中或者不相溶的有机溶剂中, 然后用微量注射器把有机相均速注射到水相（含水溶性药物）中,搅拌挥发除去有机溶剂,再超声得到脂质体。此法根据溶剂的不同可分为乙醇注入法和乙醚注入法。用乙醇注入法制备时若放慢注入速度可制得具有较高包封率的脂质体, 并且乙醇注入法避免了使用有机溶剂。乙醚注入法制备的脂质体大多为单层脂质体，粒径绝大多数在 2卩m以下，操作过程中温度比较低（40 — 50C），该方法适用于在乙醚中有较好溶解度和对热不稳定的芯材, 通过调节乙醚中不同磷脂的浓度, 可以得到不同粒径且粒径分布均匀的脂质体混悬液。许洁等[10]采用乙醇注入法制备环孢素 A 脂质体, 包封率高达 87. 09%。 2.6冷冻干燥法 采用低温干燥技术，通过反复包封、冻干和重新融合来实现较高的包封率。冻干法为提高脂质体储存期的稳定性提供了较好的解决方法，它改变了液态脂质体不稳定和易氧化的缺点，具有工艺稳定、适合于工业化生产、质量易于控制和产品稳定性好等特点。冻干法存在的问题是 :制备工艺
脂质体及其制备方法的选择
脂质体及其制备方法的 选择 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
脂质体及其制备方法的选择 1.脂质体概述 1965年，英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为４纳米。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。此两位学者曾获得过诺贝尔奖提名。 某些磷脂分散在过量的水中形成了脂质体，该脂分子本身排成双分子层，在磷脂的主要相变温度(Tm)以上，瞬间形成泡囊，且泡囊包围水液，根据磷脂种类及制备时所用温度，双分子层可以是凝胶或液晶状态。在凝胶态时磷脂烃链是一种有规律的结构，在液态时烃链是无规律的，每一种用来制备脂质体的纯磷脂由凝胶状态过渡到液晶状态时均具有特征的相变温度。这种相变温度(Tin)是根据磷脂性质而变(见下表)，它可在-20～+90℃之间变化，双分子层的不同成分混合物可引起相变温度的变化或相变完全消 都明显影响脂质体的稳定性和它们在生物体系中的行为。 脂质体根据其脂质膜的层数和腔室的数量，可以分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体，单层脂质体。不同类型的脂质体其结构特点各不相同，见下图表。 1971年，英国Rymen等人开始将脂质体用作药物载体。所谓载体，可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被巨嗜细胞吞噬后载体被酶类分解而释放药物，从而发挥作用。它具有类细胞结构，进入动物体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，也是目前国际上最热门的制药技术。
实验十 脂质体的制备及包封率的测定
实验十脂质体的制备及包封率的测定 一、实验目的 1．掌握薄膜分散法制备脂质体的工艺。 2．掌握用阳离子交换树脂法测定脂质体包封率的方法。 3．熟悉脂质体形成原理，作用特点。 4．了解“主动载药”与“被动载药”的概念。 二、实验指导 脂质体是由磷脂与（或不）与附加剂为骨架膜材制成的具有双分子层结构的封闭囊状体。常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团，将适量的磷脂加至水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相对缔和为双分子层，构成脂质体。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这两种附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而改变脂质体的包封率、体内外其他参数。 脂质体可分为三类：小单室（层）脂质体，粒径为20~50nm，经超声波处理的脂质体，绝大部分为小单室脂质体；多室（层）脂质体，粒径约为400~3500nm，显微镜下可观察到尤如洋葱断面或人手指纹的多层结构；大单室脂质体，粒径约为200~1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多为这一类。 脂质体的制法有多种，根据药物的性质或需要进行选择。（1）薄膜分散法：这是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。此法优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。（2）注入法：有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醚注入法”是将磷脂等膜材料溶于乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55~65℃含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1~2h，即可形成脂质体。（3）逆相蒸发法：系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂，如氯仿中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。（4）冷冻干燥法：适于在水中不稳定药物脂质体的制备。（5）熔融法：采用此法制备的 45
简述亲水性药物脂质体的制备(1).
简述亲水性药物脂质体的制备(1) 一，前言 脂质体作为一种新型的载药系统，今年来得到广泛的应用和研究。评价脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等。其中包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。对于亲脂性药物，由于其对磷脂膜的亲和性，可以在制备过程中得到很高的包封率，且不易渗漏。而亲水性药物在制备时则必须包封在脂质体囊内部或多层脂质体层间的水性介质中，除一些特殊药物外包封率普遍不高，且易泄露。制备中为了得到更大的包封率，不得不增加囊内的容积，而这与控制脂质体在有效的粒径范围内又相互矛盾。以下将介绍一些用于提高亲水性药物在脂质体中的包封率的方法。 二，制备方法 1，常规方法 对于一些亲水性药物，使用常规的制备方法也可以得到满意的包封率。胡静等（1）用简单的薄膜水化-机械分散法研究了硫唑嘌呤（Aza）脂质体包封率的影响因素。这些因素包括卵磷脂与胆醇摩尔比、缓冲液(PBS)pH值、水相用量及药脂重量比。通过正交设计得到最佳处方所制得的3批硫唑嘌呤脂质体形态圆整，大小均匀，粒度范围0.01～0.42μm，包封率均达30%以上。但在实验中发现药脂重量比增加时，包封率反而下降，这说明Aza的利用率在减少。 吴骏等（2）使用逆相蒸发法制备阿昔洛韦ＡＣＶ脂质体，经过正交优化后，得到阿昔洛韦脂质体的平均粒径为219.8ｎｍ，多分散系数为0.158，包封率为65%，且具有良好的稳定性。作者将卵磷脂、胆固醇、油酸和去氧胆酸钠溶于乙醚，于室温搅拌下滴入ＡＣＶ水溶液，使形成稳定的Ｗ/Ｏ型乳剂。25℃减压蒸去乙醚，得乳白色混悬液，通过微孔滤膜后，即得ＡＣＶ脂质体。产品经离心加速实验表现出良好的稳定性。此实验通过选择适当的油水体积比可使内相体积增加，提高包封率；同时加入了乳化剂可以防止脂质体的粒径增大。 翟光喜等（3）也将表面活性剂胆酸钠引入脂质体的处方中制备了低分子肝素的柔性纳米脂质体，此类脂质体具有高度的形变性，可由于经皮给药系统。制备方法就是简单的将处方混合后至冰水浴中超声处理，再通过微孔滤膜即得。经正交优化后包封率可达到33.1%。但该制剂的稳定性和储存中的渗漏作者并没有做进一步研究。陈鹰等（4）也研究了双氯芬酸钠的柔性脂质体，试验将磷脂等脂溶性成分和胆酸盐溶于乙醚中，药物则溶解在磷酸缓缓冲液中，混合后减压旋转挥干后再超声过滤。得到的脂质体包封率为73.12%。 侯新朴等对低包封率的水溶性药物(如甲硝唑)进行疏水衍生化，其疏水链将药物分子插入脂质体膜，包封率和稳定性都提高十多倍（5）。 在这些常规的制备方法中，首先应该对药物的性质有充分的了解。同时工艺参数的选择，尤其是合适的油水相比及乳化剂的用量对于水溶性药物的包封率有很大的影响。在制备过程中采用超声，加乳化剂的方法都可以有效地控制脂质体的粒径。
脂质体制备要领
微脂體(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂體(又称脂质体) 微脂體起源於1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含鹽分的水溶液後，再加以搖晃，會使脂質形成具有通透性的小球；1 968年，Sessa 和Weissmann 等人正式將此小球狀的物體命名為微脂體（lip osome）並做出明確的定義: 指出微脂體是由一到數層脂質雙層膜(lipid bilaye r) 所組成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂體由脂雙層膜包裹水溶液形成，由於構造的特性，可同時作為厭水性（hydrophobic）及親水性（hydrophilic）藥品的載體，厭水性藥品可以嵌入脂雙層中，而親水性藥品則可包覆在微脂體內的水溶液層中。如同細胞膜，微脂體的脂質膜為脂雙層構造，由同時具有親水性端及厭水性端的脂質所構成，脂雙層由厭水性端相對向內而親水性端面向水溶液構成，組成中的兩性物質以磷酸脂質最為常見。微脂體的形成是兩性物質在水溶液中，依照熱力學原理，趨向最穩定的排列方式而自動形成。微脂體的性質深受組成脂質影響，脂質在水溶液的電性，決定微脂體是中性或帶有負電荷、正電荷。此外，磷酸脂碳鏈部分的長短，不飽和鍵數目，會決定微脂體的臨界溫度(transition temperature, Tc)，影響膜的緊密度。一般來說，碳鏈長度越長臨界溫度越高，雙鍵數越多則臨界溫度越低，常見的DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylch oline)的臨界溫度分別是42℃與56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)與POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 則低於0℃。臨界溫度影響微脂體包裹及結合藥物的緊密度，當外界溫度高於Tc時，對膜有通透性的藥物，較容易通過膜；此外，當外界溫度處於臨界溫度時，微脂體脂質雙層膜中的脂質，會因為流動性不一致而使微脂體表面產生裂縫，造成內部藥物的釋出。在磷脂質內加入膽固醇，會對微脂體性質產生下列影響：增加微脂體在血液中的安定性，較不易發生破裂；減少水溶性分子對微脂體脂膜的通透性；增加微脂體的安定性，使其在血液循環中存在的時間較長。 微脂體可依脂雙層的層數或是粒子大小，加以命名或分類： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多層脂雙層之微脂體，粒子大小介於100-1000 nm，特色是粒子內具多層脂質膜，一般而言，乾燥後的脂質薄
试验十五脂质体的制备
实验十五脂质体的制备 一、目的要求 1．掌握薄膜分散法和逆相蒸发法制备脂质体的工艺。 2．掌握用阳离子交换树脂法测定小檗碱脂质体包封率的方法。 3．熟悉脂质体形成的原理及其作用特点。 二、实验提要 1.含义 脂质体是指药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中所制成的超微型球状的药物载体。根据类脂双分子层的层数的不同，脂质体可分为单室脂质体（含大、小单室）和多室脂质体。 2.制备要点 脂质体的制法有多种，应根据药物的性质或需要进行选择。经典的薄膜分散法可形成多室脂质体，再经超声处理可得到小单室脂质体。此法操作简便，但包封率较低。注入法有乙醚注入法和乙醇注入法两种，乙醚注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55℃~65℃水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1小时～2小时，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10%～20%乙醇。此法适用于不耐热的药物。反相蒸发法是制备多层脂质体或大单室脂质体的方法，此法包封率高。冷冻干燥法适用于水中不稳定药物脂质体的制备。熔融法制备的脂质体为多相脂质体，其性质稳定，可加热灭菌。 3.质量评价指标 有粒径、粒径分布和包封率等。包封率是评价脂质体内在质量的一个重要指标，常见的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤膜法和阳离子交换树脂法等。阳离子交换树脂法是利用离子交换作用，将带正电荷的未包进脂质体中的药物（即游离药物），如本实验中的游离小檗碱，吸附除去。而包封于脂质体中的药物，由于脂质体带负电荷，不被阳离子交换树脂吸附，从而达到分离的目的，用以测定包封率。 4.其他 制备脂质体的材料主要有磷脂和胆固醇。磷脂有天然磷脂（豆磷脂、卵磷脂等）和合成磷脂（二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等）。胆固醇为两亲性物质，是常用的附加剂，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体。其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质