牙周膜干细胞流式鉴定步骤
牙周膜干细胞流式鉴定步骤
1. 牙周膜组织收集：将牙周膜组织放入冰上进行碎裂，以消除坏死细胞。
2. 单个细胞悬浮：使用去粒子液将牙周膜组织悬浮，将组织中的单个细胞分离出来。
3. 标记：使用染料标记干细胞，以便于在流式细胞术中识别干细胞。
4. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞在流式细胞仪中检测，通过转速、检测光强度等参数判断细胞是否为牙周膜干细胞。
5. 数据分析：将流式细胞仪取得的数据进行处理，计算出牙周膜干细胞的比例。
牙周膜干细胞的研究进展_0
牙周膜干细胞的研究进展 牙周组织工程是牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞是其关键种子细胞之一。本文就牙周组织工程的相关研究和牙周膜干细胞的来源、分离与培养、细胞表型、生物学特性、功能影响因素和分子调控进行综述，并对其面临的挑战和前景作一讨论。 标签：牙周组织工程；牙周膜干细胞；挑战；展望 Research progress on periodontal ligament stem cellsDong Zhengmou1，2, Liu Luchuan1.（1. Dept. of Stomatology, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China; 2. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Hongan, Huanggang 438400, China）[Abstract]The periodontal tissue engineering has been a striking research on the treatment of periodontal dis－ease, and the periodontal ligament stem cell is one of the key seed cells on the periodontal tissue engineering. In this study, a related research on periodontal tissue engineering, and the source, isolated and cultured, cell pheno－type, biological characteristics, influential factor of function, molecular regulation on the periodontal ligament stem cells would be reviewed, meanwhile the challenges and prospects on it would be discussed. [Key words]periodontal tissue engineering；periodontal ligament stem cell；challenge；prospect 牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织破坏或缺损，严重影响人类的生理和心理健康。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物或引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一，本文就其研究现状和进展作一综述。 1牙周组织工程学 牙周组织工程学是将获得的种子细胞和或调控因子种植于具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，并将这种生物复合体植入牙周组织以形成新的具有原来特殊形态和功能组织的技术和方法，为牙周病的治疗研究开辟了新的思路。 1.1牙周组织工程的种子细胞 种子细胞是牙周组织再生工程的基础。牙周膜细胞（periodontal ligament cell，PDLC）分化、增殖能力较强，是常用的牙周组织工程种子细胞[1]；牙龈成纤维细胞、成牙骨质细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）[2]、牙胚细胞、
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型 （CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定
人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定目的体外分离培养人的炎症牙周膜干细胞和正常的牙周膜干细胞，并从形 态学和表面分子表达率比较两种细胞的差别，为体外分离、培养炎症牙周膜干细胞提供理论依据。方法体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干细胞（PDLSCs），体式显微镜下观察细胞表面形态，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定。 标签：牙周膜干细胞；炎症 牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。该实验证明了牙周炎症再生组织中应该存在具有干细胞特性的细胞。Chen 等[6]将临床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成组织切片，使用免疫组化染色观察发现，在牙周炎患牙的牙周组织中，STRO-1、CD146 和CD44 阳性细胞分布情况与健康牙周组织近似，而牙周膜干细胞表面的阳性标记物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、阴性标记物是CD31 CD45，所以本实验利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45对牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞（i-PDLSCs）进行鉴定。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 1.2 主要器械：眼科剪、眼科镊、刀柄、11 号刀片、平底培养皿、25cm2培养瓶、10ml离心管、平底 6 孔板（Corning，美国）、金属滤器。
牙周膜干细胞的表型分析
牙周膜干细胞的表型分析 贺慧霞;刘洪臣;王东胜;鄂玲玲;马攀 【摘要】目的:分析人牙周膜干细胞(PDLSCs)的表型特点,为分离、鉴定和应用PDLSCs提供有效途径.方法:采用免疫磁珠法分离PDLSCs,制备细胞爬片.分别采用免疫荧光、免疫细胞化学染色法检测PDLSCs表面蛋白STRO-1、CD44、Vimentin、CK、COL-Ⅰ、BSP的表达.收集PDLSCs,采用RT-PCR法检测PDLSCs Scleraxis mRNA、Col Ⅰ及CAP mRNA的表达情况.结果:PDLSCs表达 间充质干细胞表面标志STRO-1、CD44,强阳性表达间充质来源细胞表面蛋白Vimentin,弱表达Col-Ⅰ,不表达上皮细胞标志蛋白CK、成骨细胞相对特异性蛋白BSP.RT-PCR也显示PDLSCs表达韧带组织特异性基因Scleraxis和Col-Ⅰ,不表 达成牙骨质细胞特异性蛋白CAP.结论:本实验所分离的PDLSCs具有间充质来源的、牙周组织特异性的、未分化细胞的表型特点,该特点可作为PDLSCs分离和鉴定的 重要依据.%Objective: To analyze the phenotypic characteristics of human periodontal ligament stem cells(PDLSCs), and to provide new way for understanding and further application of PDLSCs. Materials and Methods. PDLSCs were isolated using an immunomagnetic bead selection system. The slides of the cells were prepared and immunofluorescence and immunocytochemical straining were performed to detect the expression of specific proteins including STRO-1, CD44, Vimentin, CK, COL-I, BSP, respectively. In addition, PDLSCs were collected to detect the the gene expression of Scleraxis mRNA, Col I mRN and CAP mRNA by RT-PCR techniques. Results: PDLSCs expressed the surface markers of mes-enchymal stem cells such as STRO-1 and CD44, and positively expressed
人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究
人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究 目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。 Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells. Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry 研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。因此，牙周膜干细胞（PDLSCs）作为一种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，一直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。已有的克隆筛选法操作程序繁琐，周期较长[1]，因此需要寻找简便、快捷的筛选方法来分离牙周膜干细胞。本研究应用免疫磁珠技术对人牙周膜干细胞进行筛选，并扩增培养，通过对牙周膜干细胞生长曲线、克隆形成率、细胞周期、细胞表面抗原标记物测定及多向分化能力的研究对其生物学特性进行研究，以期建立一种便捷有效的分离方法并明确牙周膜干细胞的生物学特性，为进一步研究牙周损伤的发病机理及临床治疗提供基础。 1材料和方法 1.1实验材料和设备：α-MEM培养基（Gibco，美国），羊抗小鼠磁珠试剂盒
送检中检验实验室间充质干细胞质量标准
送检中检验实验室间充质干细胞质量标准 1. 引言 充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为一种多功能的细胞类型，具有广泛的临床应用前景。随着充质干细胞的应用越来越广泛，不同实验室之间对于充质干细胞质量标准的一致性要求也逐渐提升。本文旨在确立送检中检验实验室间充质干细胞质量标准，以促进充质干细胞研究的进一步发展。 2. 充质干细胞质量标准的选择 为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要选择合适的评估指标。以下是一些常用的充质干细胞质量标准指标： - 表面标记物：CD105、CD73、CD90阳性；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19阴性。 - 多向分化潜能：具备成骨、成脂、成软骨等分化能力。 - 增殖能力：具备较高的增殖速度和活力。 - 免疫抑制功能：能够抑制免疫细胞的活化和增殖。
3. 充质干细胞质量标准的实验方法 为了确定充质干细胞质量标准的实验方法，可以参考以下步骤： 1. 充质干细胞的培养和扩增：选择合适的培养基和培养条件， 确保充质干细胞的良好扩增。 2. 充质干细胞的表面标记物鉴定：通过流式细胞术或免疫荧光 染色法，鉴定充质干细胞的表面标记物。 3. 充质干细胞的多向分化潜能鉴定：通过体外培养分化实验， 观察充质干细胞在不同诱导条件下的分化能力。 4. 充质干细胞的增殖能力评估：通过MTT法等细胞增殖实验，评估充质干细胞的增殖能力。 5. 充质干细胞的免疫抑制功能评估：通过淋巴细胞增殖实验或ELISA法，评估充质干细胞的免疫抑制功能。 4. 实验室间质检的建立和维护 为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要建立和 维护质检体系。以下是一些建议：
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法 肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究 具有重要的意义。本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。 1. 肿瘤干细胞培养 肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体 培养。其步骤如下： 1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。 2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。 3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。 肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外 模拟肿瘤生长和浸润的特性。此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制 的研究。 肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。主要通过以下两种方法进行： 1) 流式细胞术 通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干 细胞。常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。 2) 功能性鉴定法 此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。肿瘤干细胞应该 具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。 通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。常用的方法有磁珠分选、 流式细胞术和细胞筛等。 磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。细胞筛法是根据肿瘤干细胞的 体积和生长特性进行富集。 4. 肿瘤干细胞治疗效果评价
牙龈间充质干细胞的培养与鉴定
牙龈间充质干细胞的培养与鉴定 孙文东;孙慧斌;刘晓璇;洪润丹;徐全臣 【期刊名称】《青岛大学医学院学报》 【年(卷),期】2017(53)2 【摘要】目的分离培养人牙龈间充质干细胞,为进一步研究其对牙周炎的治疗作用提供基础。方法采用酶消化法从牙龈组织中分离培养牙龈间充质干细胞,并通过克 隆形成率、成脂成骨诱导分化、流式细胞术测定其增殖、多向分化能力及标志物的表达水平。结果牙龈间充质干细贴壁生长,细胞与成纤维细胞相似呈长梭形,可形成 明显集落。在特定的诱导条件下细胞可产生矿化结节和脂滴,干细胞标志物CD73、CD90、CD105表达均高于95%,造血干细胞标志物CD45表达低于2%。结论采 用酶消化法分离培养的牙龈间充质干细胞具有自我更新、多向分化能力,并表达干 细胞标志物,为后期实验奠定了基础。 【总页数】4页(P157-160) 【关键词】牙龈;间质干细胞;细胞培养技术 【作者】孙文东;孙慧斌;刘晓璇;洪润丹;徐全臣 【作者单位】青岛大学口腔医学院,山东青岛266005;青岛大学附属医院口腔科,山 东青岛266005 【正文语种】中文 【中图分类】R322.41;R781 【相关文献】
1.成人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用 [J], 王茜;哈小琴;白海;吴涛;路继红;杨小亮;司志刚;薛志文 2.成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用 [J], 赵微;秦俭;董嘉楠 3.牙龈间充质干细胞在大鼠体内分布情况及其分离鉴定 [J], 竺王玉;朱蓓;陈冬冬 4.人脐血间充质干细胞培养鉴定和慢病毒载体介导胶质源性神经营养因子在脐血间充质干细胞中的表达 [J], 黄爱华;王淑艳;梁庆成;吴云;关云谦;张愚;陈赞 5.西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化 [J], 孙宇辰;许龙;殷佳辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
干细胞生物安全性评估的方法与指南
干细胞生物安全性评估的方法与指南 干细胞技术作为一项具有革命性潜力的生物医学研究领域，其应用前景广阔， 可以用于治疗各种疾病。然而，由于干细胞的高度可塑性和再生能力，其安全性评估显得尤为重要。干细胞生物安全性评估的目标是评估干细胞治疗应用过程中的潜在风险，以确保干细胞疗法的安全性和有效性。本文将介绍干细胞生物安全性评估的方法和指南，以便于科学研究人员和临床医生在干细胞治疗领域做出明智的决策。 1. 干细胞鉴定与表征 干细胞安全性评估的第一步是对干细胞进行鉴定和表征。鉴定方法可以包括免 疫细胞化学染色、流式细胞术和基因表达分析等。通过这些方法，可以确认干细胞的特定表面标记物和基因表达模式，从而确定其干细胞特性。此外，需要对干细胞进行功能性评估，如多向分化能力和自我更新能力的测试，以确保其具有干细胞的特征。 2. 干细胞培养和扩增 干细胞的培养和扩增是干细胞治疗研究的关键步骤。在评估干细胞的生物安全 性时，需要确保干细胞在培养过程中不发生异常变异或表型转化。为了达到这一要求，应该采用符合良好实验室规范的标准操作程序，严格控制培养条件和培养基的成分，以减少不必要的变异风险。 3. 干细胞植入体内评估 干细胞治疗最终需要将干细胞植入患者身体内部。在进行干细胞植入体内评估时，需要考虑植入方式、剂量以及植入后的分布情况等。实验动物模型可以被用于评估干细胞在体内的存活率、分化潜力以及可能的副作用。同时，也需要对干细胞植入后的免疫反应进行评估，以排除潜在的免疫排斥现象。 4. 干细胞遗传稳定性评估
干细胞的遗传稳定性评估非常重要，因为遗传稳定性的变化可能导致异常增殖、肿瘤形成或其他不良反应。为了评估干细胞的遗传稳定性，可以采用核型分析、染色体畸变分析、DNA突变检测和基因组稳定性评估等方法。这些方法可以帮助鉴 定干细胞中的任何遗传变异，并提供针对干细胞治疗的风险评估。 5. 干细胞生物安全性指南 为了规范干细胞生物安全性评估工作，许多组织和机构已经制定了相应的指南。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了《干细胞治疗产品的临床研究指南》，详细介绍了干细胞治疗产品的规范要求和临床试验的监管政策。此外，国际细胞治疗学学会（ISCT）也发布了《干细胞治疗临床研究的指南》，提供了干细 胞治疗临床研究的最佳实践指导。 综上所述，干细胞生物安全性评估是确保干细胞治疗的安全性和有效性的重要 步骤。通过干细胞的鉴定与表征、培养和扩增、植入体内评估、遗传稳定性评估等多个方面的系统评估，可以全面了解干细胞的生物安全性情况。同时，遵循干细胞生物安全性指南可以确保评估工作的规范性和准确性。随着技术的发展和经验的积累，干细胞生物安全性评估的方法与指南将进一步完善，为干细胞治疗的临床应用提供更可靠的支持。
流式鉴定细胞表面标记物(完整版)详述
流式鉴定细胞表面标记物实验步骤 【实验流程】 一.前期样品准备 二.上机前样品的处理 三.流式细胞仪检测 四.流式检测数据分析 【具体步骤】 一.前期样品装备 1.MCF-7贴壁细胞的CD44+呈现低表达，可以不需要鉴定该细胞的CD44和CD24了。但是可以 接种一孔的MCF-7 DMSO组作为调节荧光染料PE泄露到FITC通道的补偿参考。但是一般情况下，PE染料难以染上，故可人为破坏细胞作为阳性对照组，比如加药C60或者用冰冻使细胞死亡。 2.MDA-MB-231贴壁细胞高表达CD44+，接种一孔的MDA-MB-231 DMSO组作为调节荧光染 料FITC泄露到PE通道的补偿参考。 3.调整细胞浓度使细胞第二天可以铺满即可。 所以前期样品准备可以按照下表： 注：画“——”为调补偿专用，其余为实验组，为避免细胞数目不够，实验组可以设置两个复孔。若是检测悬浮球，也可以按照以上的组别进行设置，。 二.上机前样品的处理 (一)实验步骤
1.消化：收集旧培养基并离心，用于终止贴壁细胞的消化。贴壁细胞用200uL 0.25%胰蛋白酶消化， 消化5分钟，然后加2mL离心过的培养基终止消化。 2.离心：800r/min ,离心5min，弃掉上清液。 3.重悬：加2mL PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去 上清液。加300uLPBS重悬细胞。 4.调补偿组加抗体：要设置同型对照和单染，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组。每组加 相应的抗体5~10ｕL。 5.实验组加抗体：每个实验组都要设置同型对照，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC +PE组。每组 加相应的抗体5~10ｕL。 6.加细胞悬液：分别吸取对应细胞悬液50uL于流式管中（此时细胞数至少为1×106/mL以上）。 常温避光孵育20min。 7.孵育完成后，加2 mL PBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。 8.离心后垂直倒掉上清液,再加200uL PBS重悬细胞，进行上机检测。 (二)注意事项 1.对于悬浮球的处理，第一个步骤略有不同，步骤如下：把悬浮球吸到15mL离心管中离心弃上清， 再用0.05%胰蛋白酶消化，消化5min，然后加4mLPBS终止消化。 2.样品要做好标记，流式管也做相应标记。 3.先加入抗体再加样品，保证抗体不会漏加，而且加抗体的短时间内并不容易发生荧光淬灭，故可 以不用避光。 4.离心后垂直倒掉上清液后倒置在纱布上轻轻按压，吸干管口即可，不可以甩干，不要再进行二次 倾倒，以免将细胞倒掉。 5.加入抗体和之后的PBS终止抗体反应、PBS重悬等均不可以用移液枪吹打，只能使用漩涡混匀 器来混匀。
干细胞的鉴定及应用关键技术
干细胞的鉴定及应用关键技术 干细胞是一种能自我更新并分化成多种细胞类型的特殊细胞。由于其具有许多 可塑性和潜在的治疗价值，干细胞技术已成为了生命科学领域的一个热门研究方向。在干细胞的鉴定和应用过程中，涉及多种技术手段。本文将介绍几种关键技术，以帮助读者更好地理解干细胞领域的相关技术及其应用。 1. 干细胞的鉴定 在干细胞的研究中，确保其种类和纯度很重要。鉴定干细胞的方法有很多种， 其中包括了表型特征鉴定、基因表达鉴定、分化能力等多种方法。其中，表型特征鉴定是最常用的干细胞鉴定方法之一。这种方法基于干细胞表面上特定的蛋白质和分子标志物，可以鉴定干细胞的特征。干细胞的表型特征有许多，比如胚胎干细胞(ESC) 具有 SSEA-1、Oct4 和 Nanog 等标记，但不包括 Cdx2 标记；成体干细胞(ASC)则有 CD44 和 CD133 等标记，但不包括 CD34 和 CD45 等识别血管和免疫系 统细胞的标记。通过这些标志物的免疫荧光染色和流式细胞术等技术手段，干细胞的种类、数量和纯度得以高效、精准地鉴定。 2. 干细胞的培养 干细胞培养需要提供最适宜的环境和营养成分。基础培养基的成分包括培养基液、复合物溶液和细胞因子等。培养基液可以用于给细胞提供最基本的营养成分，复合物溶液含有典型的生长因子，如 bFGF、EGF、Leukemia Inhibitory Factor (LIF)、Interleukin-6 (IL-6) 等，有利于促进干细胞的自我更新。与此相对，干细胞的分化 培养时需要不同的培养基，基于生理和化学因素的变化，以及细胞内的特定分子的表达和活性改变来改变培养基的配方。不同的干细胞培养基制作和定制的技术，越来越多地被应用于干细胞技术的开发和进一步的移植研究。 3. 干细胞的转染
肿瘤干细胞的分离和鉴定
肿瘤干细胞的分离和鉴定 随着现代医学的发展，对肿瘤的研究也日趋深入。其中一个研究方向是肿瘤干细胞的分离和鉴定。这个领域的重要性在于，肿瘤干细胞是一类能够自我更新并在肿瘤生长、转移和复发中起关键作用的细胞。因此，对肿瘤干细胞的研究有望为肿瘤治疗提供新的思路和方法。 1. 肿瘤干细胞的定义和特点 肿瘤干细胞是一类具有自我更新和多能分化特性的肿瘤细胞。它们是肿瘤中能够产生各种不同类型细胞的祖细胞，并且有能力维持肿瘤的生长和发展。与普通肿瘤细胞不同的是，肿瘤干细胞具有更强的代谢活性、更强的生存能力和更高的抗药性。此外，肿瘤干细胞能够逃避免疫系统监控，从而在肿瘤发展进程中起到重要的作用。 2. 肿瘤干细胞的分离和鉴定方法 肿瘤干细胞的分离和鉴定是肿瘤干细胞研究的基础。目前主要的方法有以下几种： （1）细胞表面标记法 通过将不同的细胞表面分子标记成不同的颜色，然后利用流式细胞术或细胞排序技术将不同的肿瘤细胞分离出来，从而分离和鉴定肿瘤干细胞。常用的肿瘤干细胞表面标记分子包括CD133、CD44、CD24等。 （2）肿瘤球形体法 肿瘤球形体法是通过将肿瘤细胞培养在特殊的培养基中，使细胞形成三维球状结构，从而富集肿瘤干细胞。随着肿瘤球体的扩大，肿瘤干细胞比例会不断增加，从而方便肿瘤干细胞的研究。
（3）功能鉴定法 通过对肿瘤细胞进行体外悬浮培养，利用细胞双层培养室将肿瘤细胞暴露在低氧环境中，从而富集肿瘤干细胞。然后通过肿瘤球体形成、体内移植等一系列功能实验验证肿瘤干细胞的存在和功能。 3. 肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的应用前景 肿瘤干细胞的存在和作用是肿瘤治疗中的重要问题。肿瘤干细胞具有较强的抗药性和低的分裂速度，这使得传统的化疗和放疗很难对其产生杀伤作用。因此，发现并针对肿瘤干细胞的治疗方法成为了肿瘤治疗的重要方向。 （1）肿瘤干细胞抗靶向药物治疗 由于肿瘤干细胞具有较强的自我更新、多能分化和抗药性等特点，它们成为了肿瘤治疗的一个难题。近年来，研究人员发现肿瘤干细胞表面分子的存在为对其进行靶向治疗提供了可能。 （2）肿瘤干细胞免疫治疗 随着免疫治疗技术的不断发展，利用免疫系统杀伤肿瘤干细胞的方法逐渐受到了广泛关注，其中包括通过抗原递呈细胞疫苗激活肿瘤特异性T细胞、利用CAR-T细胞等技术针对肿瘤干细胞进行杀伤。 总之，肿瘤干细胞的分离和鉴定是肿瘤治疗研究的重要方向之一。未来，通过对肿瘤干细胞的进一步研究，我们有望开发新的治疗方法，提高肿瘤治疗的效果和成功率。
干细胞培养中的细胞鉴定与鉴定方法
干细胞培养中的细胞鉴定与鉴定方法 细胞鉴定是干细胞培养中至关重要的一步，它能够帮助科研人员确定细胞的纯 度和特性，从而保证实验结果的准确性和可靠性。在干细胞研究中，细胞鉴定的主要目的是检测细胞的多能性和细胞表面标记物的表达情况。本文将介绍干细胞培养中常用的细胞鉴定方法，以及在干细胞培养中细胞鉴定的重要性。 一、细胞鉴定的重要性 在干细胞培养中，细胞鉴定是确保所使用的细胞符合实验要求的关键步骤。干 细胞的特性和功能对于各种研究和应用领域具有重要意义，如再生医学、药物筛选、疾病模型的构建等。因此，细胞鉴定的准确性对于确定细胞的纯度和特性是至关重要的。 细胞鉴定能够帮助研究人员确认所使用的细胞群体中是否存在其他非目标细胞 类型的杂质。通过检测细胞上的特定标记物，可以确定细胞的起源和特性，从而准确判断细胞的多能性。此外，细胞鉴定还可以帮助研究人员监测细胞培养过程中的质量控制，及时发现并排除异常细胞。 细胞鉴定的结果直接影响着后续实验的设计和结果解释。准确地进行细胞鉴定 可以确保实验数据的可靠性和可重复性，而不准确的细胞鉴定可能会导致误导性的结论或不可靠的实验结果。因此，在干细胞培养中，细胞鉴定是不可或缺的步骤，它有助于保证实验结果的准确性和可靠性。 二、常用的细胞鉴定方法 在干细胞培养中，常用的细胞鉴定方法包括细胞表面标记物的检测和多能性的 评估。 1.细胞表面标记物的检测
通过检测细胞表面标记物的表达情况，可以确定细胞类型和特性。常用的细胞 鉴定方法包括流式细胞术（flow cytometry）、免疫细胞化学（immunocytochemistry）和细胞表面蛋白质鉴定（surface protein identification）。 流式细胞术常用于检测细胞表面蛋白质标记物的表达情况。通过特定的抗体与 细胞表面标记物结合，并使用荧光染料标记抗体来实现对标记物的定量检测。该方法可以同时检测多个标记物，高通量检测，准确鉴定细胞群体中的不同细胞类型。 免疫细胞化学通过使用特定的抗体和染色剂识别并照亮目标蛋白质，从而观察 细胞中某个特定的蛋白质的分布情况。这种方法对于细胞形态特征的评估具有重要意义，可以帮助判断细胞的成熟度和功能特性。 细胞表面蛋白质鉴定是通过使用特异性蛋白质鉴定试剂盒，例如ELISA或免 疫沉淀等方法，检测细胞表面标记物的定量表达情况。该方法对于大规模筛选和高通量检测非常有效，可以用于鉴定细胞表面蛋白质的变化。 2. 多能性的评估 多能性是干细胞的重要特性之一，用于描述细胞可以分化为不同类型的细胞。 在干细胞培养中，多能性的评估方法主要包括单克隆形成性能（clonal assay）、胚 胎体外分化（embryoid body formation）和基因表达谱分析（gene expression profiling）等。 单克隆形成性能是通过将单个细胞进行分离培养，观察其能够形成克隆的能力 来评估多能性。如果一个单细胞可以分化为不同细胞类型，表明该细胞具有多能性。 胚胎体外分化是一种常用的多能性验证方法。在该实验中，干细胞会形成胚胎 类似的三维结构，称为胚胎体外团块（embryoid bodies, EBs）。EBs能够分化为包 括内胚层、外胚层和中胚层在内的多个胚层细胞。
人牙周膜干细胞膜片的制备
人牙周膜干细胞膜片的制备 赵鲁明;杨玉城;魏立梅;丁刚 【摘要】Objective To prepare the human periodontal ligament stem cell ( hPDLSC) sheet.Methods Human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured from 20 extracted premolar teeth.ALP staining and red oil O stai-ning were utilized to observe the differential ability of hPDLSC.hPDLSC sheet was prepared by adding 40μg/mL vitamin C into the culture medium, HE and SEM were used to observe the cell sheet structure.Results In this study, hPDLSC was successfully isolated and cultured; it had high colonic ability and multiple differentiation ability which complied with the characteristics of mesenchymal stem cells.SEM indicated that the cells were arranged closely, and the extracellular matrix was abundant.HE staining showed that the cell sheet was composed of 3 to 4 layers of cells.Cells and cells were closely connected, and rich in extracellular matrix.Conclusion hPDLSC sheet was prepared successfully.% 目的：制备人牙周膜干细胞（ hPDLSC）膜片。方法刮取接受正畸治疗的20例患者完整拔除的前磨牙牙周膜组织，机械分离加酶消化法分离培养人正常牙周膜细胞，采用有限稀释法克隆培养纯化hPDLSC，测算克隆形成率，检测hPDLSC的体外 多向分化潜能。向培养基中添加40μg／mL维生素C制备hPDLSC膜片，用扫描电镜及HE染色观察所制备的hPDLSC膜片的结构。结果 hPDLSC具有较高的克 隆形成率，体外诱导具有成骨成脂多向分化潜能。 HE染色显示hPDLSC膜片由3、4层细胞构成，细胞与细胞之间连接紧密，富含细胞外基质。扫描电镜显示
人牙周膜干细胞与人牙髓干细胞的表型及生长特性比较
人牙周膜干细胞与人牙髓干细胞的表型及生长特性比较 蔡洪桢;贺慧霞;王飞翔;张绍清 【摘要】目的:比较人牙周膜干细胞(human Periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)和牙髓干细胞(humanDental pulp stem cells,hDPSCs)的表型及 生长特性,为深入研究这两种细胞生物学特性提供依据.方法:组织块法培养获得原代人牙周膜细胞和牙髓细胞,采用有限稀释法分别对两者克隆化培养、分离纯化得到hPDLSCs和hDPSCs,采用倒置相差显微镜观察细胞形态、CCK8法检测细胞生长 活性并绘制两者生长曲线、流式细胞技术检测干细胞表面标志物,分析比较两种细 胞集落形成率(colony formation ratio,CFR).结果:hPDLSCs和hDPSCs镜下形态相似,生长曲线均呈“S”形,牙周膜细胞中STRO-1表达hPDLSCs阳性率为 15.88±0.48％,牙髓细胞中STRO-1表达hDPSCs阳性率为11.86±0.43％,两者无显著性差异.两种干细胞均阳性表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)表面标志物STRO-1、CD29、CD44、CD90、CD73和血管内皮标志物CD105,其中STRO-l、CD29、CD90、CD73、CD105及CD166百分率达90％以上,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45.hDPSCs的集落形成率 (4.31±0.08％)显著高于hPDLSCs的集落形成率(2.68±0.06％)(P＜0.05).结 论:hPDLSCs和hDPSCs细胞的形态相似,均高表达MSCs表面特异性标志 物,hDPSCs的集落形成率显著高于hPDLSCs,说明hDPSC自我更新能力较hPDLSCs强,可为深入研究这两种干细胞提供实验依据.%Objective:We aim to compare the biological characteristics and phenotypic after cultivating and separating of the human Periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) and human Dental pulp stem cells (hDPSCs).Methods:HPDLSCs and hDPSCs were respectively separated and amplificated ~om the original generation
干细胞流式表型鉴定
干细胞流式表型检测标准操作流程 1 目的和范围： 1.1 目的：规范干细胞流式检测的操作流程，确定干细胞的质量以 及纯度。 1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员干细胞流式检测的全 过程。 2 文件： 2.1 干细胞流式表型鉴定标准操作流程。 3 记录： 3.1 干细胞流式表型鉴定记录。 3.2溶液配制记录。 3.3清场记录。 4 试剂与耗材： 4.1试剂：PBS、质控微球、细胞悬液、FITC-CD9，PerCP-CD105,APC- CD73,PE-CD44以及同型对照、纯水。 4.2 仪器设备：超净工作台、1ml移液枪、离心机、细胞计数仪、 电动移液枪、试管架、流式细胞仪。 4.3耗材：15ml离心管、1ml枪头、封口膜、无菌纱布、上样管。5工作程序： 5.1实验前准备： 5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内 紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净 工作台备用。 5.2溶液配制： 5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照 试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。 5.2.2细胞悬液的配制：取收集的干细胞，用1ml枪头加入 10mlPBS使其浓度约2×10*6/ml，待用。 5.2.3质控样本的配制：取一支上样管，加入500ul纯水/PBS， 再滴入两滴质控微球，备用。 5.2.4检测管的配制：
5.3上机检测： 5.3.1先打开流式细胞仪，预热5分钟。 5.3.2 用PBS/纯水冲洗管道：上样管中加入PBS/纯水，进行上 机，设定run3分钟。 5.3.3待管道冲洗完之后，进行质控：将质控微球的上样管上机 检测，点开QC界面，进行检测。 5.3.4待质控检测合格之后，进行样本的检测。将5.2.4中的样 本管依次进行上机检测。 5.3.5待样本都检测完毕后，再将管道冲洗，用PBS/纯水上机 3min，再关机。 5.3.6待所有实验完成后清场，填写相关记录。 6注意事项： 6.1 在实验操作过程中，始终保持实验室洁净区空气循环系统 与超净工作台正常运行，当某一方停止运行时应马上停 止实验操作。 6.2 不能将手机及其它私人电子设备带入实验室洁净区，进入 实验室洁净区尽量避免手及手肘部、胸部与地面和墙面 接触，当接触此些部位接触地面与墙面时，应及时用75% 酒精擦拭消毒。 6.3 当手、试剂、耗材与仪器进入超净工作台前都需要用75% 酒精擦拭外表面消毒。 6.4 在超净工作台内操作时，所有的容器盖子开口朝下，并垫