毛细管电泳技术及在微生物学中的应用

湖南农业大学研究生课程论文

学院：食品科技学院

年级专业：07级营养与食品卫生学

姓名：章沙沙学号：s200700294 课程论文题目：毛细管电泳技术及在微生物学中的应用课程名称：现代食品分析技术

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毛细管电泳技术及在微生物学中的应用

学生:章沙沙

(07级食品科技学院营养与食品卫生学,学号s200700294)

摘要: 毛细管电泳技术是一种新型高效液相分离技术，应用领域广泛。本文分别从毛细管电泳技术的发展概况及在微生物学检测中的应用加以综述。

关键词: 毛细管电泳；微生物；应用

毛细管电泳迅速发展于80年代中后期,是分析科学中继高效液相色谱技术之后的又一重大进展，使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能[1]。毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。广泛应用于核酸、蛋白质、多肽、药物等大分子物质的分析，但是，不同于毛细管电泳在无机离子、有机小分子和生物大分子等方面取得的巨大成功，毛细管电泳在微生物方面的应用在最近几年才取得较大进展，并逐渐显现出巨大的应用潜力。在微生物学领域，毛细管电泳除了在微生物基因测序方面得到广泛应用外，在微生物学检测方面应用的报道不多见。本文主要介绍了毛细管电泳的发展、原理、特点、分离模式及在微生物检测中的应用。

1、毛细管电泳技术

1.1毛细管电泳发展历史

1937年瑞典化学家Tiselius[2]利用电泳技术第一次从人血清中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，并研制成第一台电泳仪，使电泳作为一种分离分析技术有了突破性的进展。经典电泳法最大的局限性在于存在焦耳热，只能在低电场强度下操作，直接影响了其分离效率和分析速度的提高，为了解决这一问题，人们进行了多方探索。1981年，Jorgenson和Lukacs[3]使用内径75um的石英毛细管进行电泳，成功地对丹酰化氨基酸进行了快速，高效分离获得了40万块/m理论塔板的高效率。这一开创性工作成为电泳发展史上一个里程碑，使经典的电泳技术发展为高效毛细管电泳（HPCE）。从此，毛细管电泳在理论研究，分离模式，商品仪器，应用领域等各方面获得了迅猛发展。如今，HPCE可与GC、HPLC相媲美，成为现代分离科学的重要组成部分[4]。

1.2毛细管电泳基本原理和分离模式

按毛细管内分离介质和分离原理的不同，毛细管电泳有以下几种分离模式[5]：

(1)毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)的分离原理是基于各个分离物质的净电荷与其质量比(比荷)间的差异而进行物质的分离。迄今CZE仍是应用最多的模式，应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子等的分离。（2）毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE)是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳，不同体积的溶质分子在其分子筛作用的凝胶中得以分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核酸、DNA片段分离和测序及聚合酶链反应(PCR)产物的分析。（3）毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱(MECC)是采用表面活性剂在运动缓冲液内形成一疏水内核，外部带负电的动态胶束相，利用溶质具有不同的疏水性，在水相和胶束相间分配的差异进行分离。主要用于小分子、中性化合物和药物等的分离。（4）毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦(CIEF)是用两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种具

有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置，形成窄的聚焦区带。已成功用于测定蛋白质的等电点、分离异构体等。（5）毛细管等速聚焦毛细管等速聚焦(CITP)利用先导电解质和尾随电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。现常用于富集样品。（6）毛细管电色谱将高效液相色谱(I-IPLC)中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程称毛细管电色谱(CEC)。以上6种模式为毛细管电泳基本模式，此外，如亲和、免疫毛细管电泳发展趋势也很好。

1.3 毛细管电泳特点

毛细管电泳与高效液相色谱一样同是液相分离技术，但无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳显示了一定的优势，与高效液相色谱相比，毛细管电泳柱效更高，可达105-106 理论塔板数/m，分离速度更快，几十秒至几十分钟间完成，同时，它几乎不消耗溶剂，而样品用量仅为高效液相色谱几百分之一，仅为几十纳升，毛细管电泳没有高压泵输液，因此仪器成本更低，可以通过改变操作模式和缓冲液的成分，毛细管电泳有很大的选择性，可以根据不同的分子性质对生物大分子，药物等极广泛的分离对象进行有效的分离，而高效液相色谱要消耗许多价格昂贵的色谱柱和流动相[6]。当然，毛细管电泳也存在一些不尽人意的地方，比如毛细管的填充需要专门的灌注技术且制备能力差，毛细管对样本的吸附难于克服从而使其分离效率下降，电泳的高灵敏度依赖于高灵敏度的检测仪等，这些都有赖于进一步完善。

1.4毛细管电泳---质谱联用

毛细管电泳---质谱联用综合了二者的优点，成为分析生物大分子的有力工具，是近年来发展迅速的联用技术。毛细管电泳---质谱联用的应用与LC-MS的应用在方法和分析对象上有许多相似之处，如都适用于小分子和大分子的分析，热不稳定，强极性分子及至离子型化合物的分离和分析，当然，毛细管电泳---质谱联用尚存在缺点如浓度灵敏度低，不如LC-MS；不是所有的毛细管电泳分离模式都可方便地用于与质谱相联用；质谱对毛细管电泳分离缓冲液的限制较多。同时，在将毛细管电泳体系与质谱仪联用时，还有以下问题需要注意[4]：（1）无论采用套液技术还是采用十字形接口，毛细管的出口处都会带有高电压。因此良好的电接触对控制接口的工作电流乃至稳定的离子化过程都是很重要的。（2）毛细管插入位置要经细心的优化，位置不当会导致电喷雾工作不稳定。（3）以往发表的毛细管电泳分离工作多数都是在磷酸盐缓冲液中完成的，在毛细管电泳和质谱相连接时要调整为易挥发盐的缓冲液。几种适宜的缓冲液及其浓度：<100mmol/l的甲酸乙酸混合溶液；<50mmol/l的乙酸氨溶液；<10mmol/l十六烷基三甲基氯化铵溶液。（4）为解决毛细管电泳进样量小，不足以在质谱上检出的问题，可以采用等速电泳对样品进行柱上浓缩，以提高进样浓度。

2、毛细管电泳在微生物学中的应用

2.1 CE在病毒检测中的应用

病毒的检测大多采用细胞培养以及免疫学方法，但是细胞培养是非常繁琐的，而免疫学方法也存在交叉反应等问题。Erdman等[7]将CE与RT-PCR联合起来，建立了基于CE技术的基因扫描RT-PCR法来检测患儿呼吸道中感染的6种常见的病毒。首先采用RT-PCR对样本进行扩增，然后使用基于CE技术的ABIPrism 310基因分析仪对扩增产物进行基因扫描分析。采用该法对临床标本进行了检测，其中病毒培养或直接免疫荧光法而确定为阳性的93份样本，该法86

例阳性；而病毒培养或直接免疫荧光法判为阴性的116例病人，该法却检出了119株病毒。Margraf等[8]采用异源双链核酸迁移率分析(HMA)并结合温度梯度CE(TGCE)的方法对HCV进行

基因型鉴定。即采用RT-PCR对HCV 5 非转录区的一个56 bp的基因区域进行扩增，将扩增产物和已知基因的扩增子进行杂交；然后对杂交产物进行TGCE分析，依据不同的基因型产生的峰形差异进行基因型鉴定。采用该法对已知的200个HCV的基因型进行了鉴定，其中97％得到正确鉴定。还发现部分没有得到正确鉴定的HCV基因型存在着基因变异。

2.2 CE在细菌检测中的应用

细菌表面既包含正电荷基团又包含负电荷基团，因而细菌可被看成两性物质。细菌为胶体颗粒，表面积极大，而且覆盖着许多物质如多糖类、肽聚糖、脂类等。这些化合物在电泳缓冲液中可因解离和吸附形成双电层，因而毛细管电泳能将细菌当作“离子”看待[9]。细菌在一定的生理条件下，其表面基团的电离状态和双电层的厚度是电泳缓冲液种类、pH值、离子强度和温度等参数的函数，可以通过优化这些参数分离不同种类的细菌。细菌在电泳过程中受电场力和摩擦力作用，其迁移时间可作定性的依据，其峰高或峰面积则是定量的基础。毛细管电泳理论指出，分离柱效随样品分子扩散系数或分子量的增大而上升，这就预示着CE 在细胞分离中具有独特的优势。

20世纪80年代以来，毛细管电泳技术在细菌分析、分离和鉴定中逐渐得到了运用。1987年njerten等展示了CE在细菌分析方面的前景，他们成功地分离了干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)[10] 。1988年,Uhlenbruck等人首次利用毛细管电泳技术对细菌进行了分类。与此同时，Ebersole和McCormick用毛细管电泳对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)5种细菌进行了分离，发现不同发育阶段的菌体细胞对应着不同的特征峰，而且大多数细菌在电泳后仍能保持活体状态[11]。细菌电泳在实际操作中要获得很好的准确性和重现性有一定难度。主要原因是细菌表面状况因培养条件的不同而有差异；其次在电泳过程中，有些细菌细胞可能会破碎；同时细菌的代谢产物在表面的积累或释放对电泳缓冲液也有影响；此外，细菌还可能在生长过程中形成紧密相连的聚合体。因此，细菌电泳的关键在于细菌的培养、缓冲液的选择及样品的前处理等[12]。

Armstrong等[13]首次将毛细管等电聚焦技术用于细菌的分析分离，能在18min内将E-coli、P．putida和深红沙雷氏菌(Serratia rubidae)很好地分离，得到每米l，600，000理论塔板数的极限分离柱效。与常规等电聚焦相比，昂贵两性电解质的微量消耗和高效分离效果是其引人注目的优点。但这种方式不能保证电泳分离后细菌的活性。在Armstrong研究组的工作中，以TBE—PEO缓冲液体系从人尿样中快速检测到引起尿路感染的病原菌腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和E.coli 23501[14]。粉状奶制品添加物中的活性菌婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和药片中的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)也能快速定性定量分析[15]。不仅如此，他们通过对细菌进行荧光染色，应用激光诱导荧光检测器，可将细菌的鉴定、浓度的测定和生理状态的检测在十几分钟内的一次电泳中实现[16]

2.3 CE在真菌检测中的应用

Turenne等[17]将PCR和自动荧光毛细管电泳系统相结合建立了快速鉴定真菌的方法，首先使用真菌通用引物1TS86、ITS4对各种真菌的ITS-2区域进行扩增，然后采用自动荧光毛细管电泳系统对扩增片段进行分析，依据不同真菌问扩增片段长度的差异而将其区分开。采用该法仅需不到7h就能完成，是一种适用于真菌血症和其他真菌感染的诊断方法。Chen等[18]采用通用引物1TS3、ITS4对多种酵母的1TS2区域进行扩增，然后进行分辨率达1bp的cE分析，依据扩增片段的长度差异鉴定各种酵母。研究表明，92％的临床菌株能够被正确鉴定，剩下的8%通过ITS-2的测序或RFLP而被鉴定。后来Chen等[19]又采用引物ITS1、ITS2对酵母的1TSI 1

区域进行PCR扩增，然后进行CE分析。结果表明，l9种酵母可以通过ITS-1区域扩增片段的长度差异而得到鉴定。如果联合ITS-1和ITS-2区域扩增片段的长度差异，则可以鉴定30种酵母，其余的有相同长度扩增片段的l0种酵母，通过ITS区域的测序或包含ITS-1和ITS-2区域的RFLP可以进行鉴定。

3展望

毛细管电泳技术既是电泳分离技术的进步，又是分析仪器运用的创新。目前，毛细管电泳技术研究的重点在于扩大其应用范围，完善和发展应用方法。相信随着毛细管电泳技术的不断进步，它在微生物的分离、鉴别和定量分析发面将会取得更广阔的应用前景。

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