毛细管电泳的基本原理及应用
毛细管电泳的基本原理及应用
摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。
关键词：毛细管电泳原理分离模式应用
1概述
毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。
毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。
2 毛细管电泳的设备和基本原理
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法[3]。毛细管电泳仪的基本组成如图1、1 所示。
熔融石英毛细管的两端分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶中，毛细管内也充满同样的电解缓冲液。在毛细管接收端之前安装在线检测系统。被分析样品可以从进样系统采用重力法、电迁移法、抽真空法等多种进样方式引入到毛细管的进样端。当样品被引入后,便开始在毛细管两端施加电压。样品溶液中溶质的带电组分在电场的作用下根据各自的荷质比向检测系统方向定向迁移。CE中的毛细管目前大多是石英材料。当石英毛细管中充入 pH值大于 3的电解质溶液时 ,管壁的硅羟基(- SiOH)便部分解离成硅羟基负离子(- SiO-) ,使管壁带负电荷。在静电引力下 ,- SiO-会把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电层(见图2[4])。
在外电场作用下 ,上述阳离子会向阴极移动。由于这些阳离子实际上是溶剂化的(水化的)，它们将带着毛细管中的液体一起向阴极移动，这就是 CE中的电渗流(EOF)。电渗流的强度很高，以致于所有进入毛细管中的样品，不管是阴离子、阳离子或中性分子，都会随着液体向阴极移动。因待测样品中正离子的电泳方向与电渗流方向一致，故最先到达毛细管的阴极端;中性粒子的电泳速度为零 ,迁移速度与电渗流速度相当；而负离子的电泳方向则与电渗流方向相反，但因电渗流速度约等于一般离子电泳速度的 5～7倍[5]，故负离子也将在中性粒子之后到达毛细管的阴极端。由于各种粒子在毛细管内的迁移速度不一致，因而使各种粒子在毛细管内能够达到很好的分离。
3 毛细管电泳的分离模式
根据分离原理不同，CE分离基本模式有6种，如表 1 所示。
表 1 毛细管电泳的分离模式和应用
Tab. 1 Separation modes and application of CE
以上各模式以毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱这3种应用较多。
4 毛细管电泳的应用
4.1 CE在药物成分分析中的应用
目前，CE在天然中草药分析领域中的应用主要集中在生物碱和黄酮及其甙类方面、蒽醌类分析也有报道。生物碱有类似于碱的性质，在pH < 7的缓冲液中利用 CZE 分离。纪秀红等[6]选取马钱子碱为内标物，在磷酸/甲醇缓冲溶液中 ,测定了小檗碱、巴马亭、药根碱的含量。黄酮类化合物大多是中性分子，主要采用 MECC 模式分离。LiYM[7]以SDS(十六烷基磺酸钠)为阴离子表面活性剂将黄芩中的 6 种主要的黄酮类化合物分离。李伟等[8]以磷酸盐为缓冲体系 ,利用 CZE 模式分离、测定了大黄提取液中离蒽醌化合物的含量。
4. 2 CE在手性拆分中的应用
CE因其高效、快速、选择性强的特点而成为目前最有效的手性拆分方法。各种CE分离模式皆可用于对映异构体分离，因此手性拆分成为 CE应用最活跃、最独特的领域。其中，添加剂法只需向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，经过一定的分离条件优化即能实现手性分离。又因为可选择的添加剂种类很多，此法是 CE进行手性拆分的主要形式。目前 ,主要的手性添加剂有环糊精类（CDs)、冠醚类、大环抗生素、蛋白质等。仅环糊精一类就有α-CD，β-CD，γ-CD，HP -α-CD， CM-β-CD 等多种添加物质 ,其应用十分广泛。此外，其他种类添加剂的应用结合 MECC和 NACE 模式基本上能实现各种手性药物的拆分[9～11]。
4.3 CE用于肽和蛋白分析
CE在蛋白质分离分析中的应用主要包括肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、定性和动力学研究。C E在肽和蛋白质的别分析中应用最多的是CZE测定肽谱， SDS-CGE测蛋白分子量及CE-MS直接测定分子量。用CZE还可测定蛋白的物理参数，如蛋白的有效尺寸、电荷和扩散系数。用CIEF测定蛋白等电点比平板凝胶电泳测等电点的方法简单，
可直接监测。蛋白被酶解或化学裂解成肽片断，利用CZE的高分辨率分离后所得的电泳图称CE肽图。肽图是进行蛋白序列分析的第一步，随后可用CE进行微量制备，再测定各片断的氨基酸序列，即可得出整个蛋白的一级结构。CE的制备总量比高效液相色谱低，只适用于微量制备。对扩散系数小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用来作为收集非常纯的单一馏份的微量制备的手段。在有些情况下，CE定量线性范围可达(3个数量级)。
4.4 CE用于糖类的分析
近年来，毛细管电泳已成为分析单糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖类化合物的有力武器，在糖型分析。方面也取得了较大的成功单糖的pKa6值一般大于11，故需选用强碱性的缓冲液（pH>11），使糖基上的羟基去质子而带负电荷，直接进行电泳分离，用紫外（195nm）检测。也可以选用硼酸盐缓冲液，硼酸盐与糖基络合形成带负电荷的络合物以进行电泳分离，用紫外检测。简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析[12]。多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析。糖蛋白经蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的图谱被认为是糖蛋白的指纹图谱。糖肽的分离主要是基于其pKa值的不同而进行CE分离，并不是基于糖链结构的不同，因此所选用的缓冲液的组成及其pH的选择尤为重要，其检测也是基于蛋白质的检测。糖脂既可以直接用CE分离，也可以用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来后进行分析。糖胺聚糖（GAG）类糖基的聚糖部分有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，一般都含有重复的二糖单元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，这些寡糖既带电荷又有紫外吸收（232nm），因此很适合用CE进行分析。另外，CE在糖型分析方面也取得了较大的成功。在糖的检测方面，紫外分析是最早用于CE进行糖类检测的，但它的灵敏度相对不高，检出限一般只有10—6mol数量级。利用激光诱导荧光检测对糖类进行柱前高效荧光标记，可使检出限达到10-9mol水平。在改进检测系统的同时，中性糖类的极性标记也在不断改进与完善。其中一种极性标记物为8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地对均一寡糖和复杂多糖进行分离分析，具有很高的分辨率。
4.5 CE在临床化学上的应用
CE 在临床化学中的应用十分广泛, 所检测样品的来源可分为尿样、血浆血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织以及实验动物活体(invivo)试验。被分析的组分则包括肽类、各种蛋白、病毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子、药物及其代谢产物。具体应用可分为: 临床疾病诊断临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶链反应(PCR )产物分析、DNA 片断及序列分析等。所应用的CE 模式包括CZE、MECC、CGE、CITP 和毛细管等电聚焦(CIEF)[13.14]。
4.6 CE用于检测非均一性(多样性, Heterogeneity)
许多纯化蛋白, 甚至在它们的天然状态, 往往都不是单一分子片断, 而是由相关分子组成, 称为非均一性(多样性)。产生多样性的原因有: 氨基酸(AA )的序列不同, 如突变体的某位置AA 改变或AA 侧链改变; 后转译产生不同长度的多肽链; 糖蛋白不同程度的糖基化, 如存在不同数量的寡糖链, 寡糖链有不同的单糖组成、序列及单糖之间的异构连接。采用CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可检测这些非均一性。用于心脏病的重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA )含 4 个可能糖基。Yim [15]用 CZE 和CIEF 研究了制备过程中 rtPA 不同糖基化程度引起的非均一性, 结果表明, CIEF方法要比CZE的好。还有用CZE 对人促红细胞生成素( rHuEPO )[16]、用MECC对重组人C2干扰素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研究蛋白的多样性。有关蛋白的非均一性在临床中的一些应用, 如人铁传递蛋白、血清蛋白的变异、异构酶的分析等。
4. 7 CE用于农药残留量的分析
对农药残留物的测定国外研究的较多。Lazer等[19]将飞行时间质谱和毛细管电泳仪联用，采用样品堆积技术进样对 Paraquat 和 Diquat 两种除草剂进行了分离，检测限低至 10- 17mol/L。Farran等[20]采用φ(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂缓冲液分离出两种苯氧羧酸类除草剂。Hinsmann 等[21]通过自动在线浓缩样品，采用固相微柱以十二烷基硫酸钠(SDS)作胶束 ,添加少量乙腈 ,在13min内分离测定了水中的7种不同种类的农药。磺酰脲类化合物是一类相对较新的除草剂，
因此这一类化合物在水和食品中的残留量的测定十分重要。Lipez Avila等[22]采用3μmODS硅胶填充柱来分离这一类化合物 ,线性范围为1～100mg/L。Mayer 等报道了农药Cinosulfuron 及其副产物的毛细管电色谱的分离分析。游静等[23]对毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述。
4.8 CE用于纯度检测
CE在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已广泛用作最有效的纯度检测手段。当蛋白的疏水性相近时, 它们在HPLC 柱中往往同时流出, 因此在对蛋白进行结构研究(包括N 端序列和肽谱)之前, 必须监测从HPLC 所得肽片断的纯度。快速CE 纯度检测可节约样品和节省序列测定所需时间。因CE 和RP2 HP LC 分离机理不同, 所以当用CE 检查由RP2HPLC 纯化制得的某一合成肽(一个峰, 纯度为 99.12% )时, 发现分出 6 个组分, 主峰纯度仅为50%。或许这就是部分基因工程产品用HPLC 检测纯度很高而实际生物活性却各批差异很大的一个原因。至于用CE 对药厂生产及QC 作纯度检测的应用实例比比皆是, 如对胰岛素、白细胞介素、人生长激素、粒性巨噬细胞菌落刺激因子(用CIEF )等的检测。纯度检测时用CE 可检测出多肽链上单个氨基酸的差异。CE 用于纯度检测可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多种模式。还有文献讨论了用不同方法(包括R P2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)进行纯度检测的最有效的策略[24]。
5 结论
作为一种蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的重要技术，近20年来，毛细管电泳的机理探索和应用研究都取得了长足的进展，对毛细管电泳的研究，使其分离效率和分析精度不断提高，也使其应用领域不断扩大，推动了生物技术的不断发展。毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性。同时，增加自动进样装置和使之微机化、商品化。另外，将它与质谱仪更好地结合，可对生物分子特性作出更快、更准确的分析，以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的应用范围。
毛细管电泳实验报告
毛细管电泳实验报告 高乃群S0 实验目的 1.了解毛细管电泳实验的原理 2.掌握毛细管电泳仪的操作方法,并设计样品组分的分析过程. 3.学会处理实验数据,分析实验结果. 实验原理C E所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。 一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。
实验设备：电泳仪。仪器及试剂： 缓冲溶液(buffer)：20 mmol/L Na 2B 4 O 7 缓冲溶液。1mol/L NaOH溶液，二次 去离子水。未知样饮料（雪碧和醒目） 1．实验步骤仪器的预热和毛细管的冲洗：打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min， 二次水5 min，10 mmol/L NaH 2PO 4 -Na 2 HPO 4 1:1缓冲溶液5 min，冲洗过程中出 口(outlet)对准废液的位置，并不要升高托架。 2．混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制标样苯甲酸浓度依次为、、、、1 mg/ml。 3．做标准曲线：待毛细管冲洗完毕，取1 ml混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪进口(Inlet)托架上sample的位置，然后调整出口(outlet)对准缓冲溶液(buffer)，升高托架并固定，然后开始进样。进样压力30 mbar，进样时间5 s。进样后将进口(Inlet)托架的位置换回缓冲溶液(buffer)，切记换回buffer 的位置！选择方法，修改合适的文件说明，然后开始分析，电压25 kV，时间约10 min。 4．未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，分析时间约25min，据苯甲酸钠标准曲线测雪碧与醒目这两种饮料中的苯甲酸钠的
pcr技术原理简介
PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引
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PCR原理及过程
PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL
毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展
信阳师范学院 研究生课程论文 2014—2015学年第1学期 毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展提交日期：2015 年 1 月 6 日研究生签名：
毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展 姓名：学号：2 摘要：生命与健康是关系人类生活和可持续发展的永恒话题。为了检测食品中的有毒物质和人类身体内的有害物质，并达到快速检测和灵敏度高的目的，毛细管电泳(CE)和电化学发光(ECL)技术相结合的方法应运而生。这种方法充分利用了CE技术快速、灵敏、需样量少的优点及ECL线性范围宽和仪器简单的特点，使其在生命和医药等方面得到了广泛的应用。 关键词：毛细管电泳；电化学发光；生命；医药 引言 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis，CE)也叫做高效毛细管电泳(HPCE)，是二十世纪八十年代问世的高效液相分离法之一[1]，是将经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。它是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(大小、电荷、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为依据的液相微分离分析技术。与传统的分离分析方法相比，毛细管电泳显著特点是简单、高效、快速和微量。另外，毛细管电泳还有经济、清洁、易于自动化和环境污染小等优点。因此，毛细管电泳迅速发展为高效的分离和检测技术，广泛应用于物质的检测与分离。 电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是指电极表面通过电子的转移形成激发态，电子从激发态返回基态而产生的发光过程[2]，由电极上施加的电压所引发和控制[3]，以电激发为驱动力，通过电化学反应产生光信号。因此，电化学发光兼有化学发光的特点，是一种可控性强，灵敏度高的检测方法。 将毛细管电泳和电化学发光技术联用，产生了毛细管电泳-电化学发光检测技术(CE-ECL)，该技术兼有CE微量、迅速、高效及ECL高选择性、高灵敏等特点。这些特点使CE-ECL检测技术在药物分析、生命分析等领域应用越来越广泛，在实际样品的分离和分析工作中也发挥着重要的作用。本文主要简述毛细管电泳-电化学发光联用技术在各个领域的应用进展。 1. 毛细管电泳-电化学发光联用技术
毛细管电泳及其应用
毛细管电泳及其应用 摘要：毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)，是近二十年来发展最为迅速的新型液相分离分析技术之一。CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是继高效液相色谱之后的又一重大进展，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。毛细管电泳这些特点使其成为一种极为有效的分离技术，目前已是生命科学及其它学科中一种常用的分析手段，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物等的分离分析。关键词：毛细管电泳，分离效率高，生命科学 引言 毛细管电泳是在传统电泳技术的基础上逐步发展起来的。电泳技术的出现可以追溯到100多年前[1]。1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。起初电泳只是作为一种物理化学现象来研究。电泳真正意义上进入分析化学被视为一种重要意义的技术，是在瑞士化学家Tiselius[2]公布了移动界面电泳技术的细节之后。他首先将电泳现象成功的应用于人血清的分离，获得了多种血清蛋白，他制成第一台电泳仪，并进行自由溶液电泳。Tisedius对电泳技术的发展和应用所做的巨大贡献，使他获得了1948年诺贝尔化学奖。但是传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。1967年Hjerten[3]最先使用慢速旋转的内径为3 mm的石英玻璃管进行自由溶波电泳，以UV进行检测，成功地分离了蛋白质、多肽、无机离子、有机离子等，Hjerten最早证明可以把高电场用于细内径的毛细管电泳，但他没有完全克服传统电泳的弊端。1974年Virtanen提出使用细毛细管提高分离效率，阐明电渗流就像泵一样可以驱动液体流过毛细管，并说明了使用更细内径的毛细管做毛细管电泳的特点。1979年Everaerts和Mikkers[4]使用内径为200μm聚四氟乙烯毛细管，提高了毛细管的分离效率，成功分离了16种有机酸。1981年Jorgenson和Luckas[5]发表了划时代的研究工作，采用内径为75μm 石英毛细管进行实验，采用高电场电迁移进样，以灵敏的荧光检测器进行检测，使丹酞化氨基酸高效、快速分离，首次获得理论塔板数高达4x105/m的柱效。Jorgenson和Lucas等人的开创性工作，使CE发生了根本性的变革，标志着CE从此跨入高效毛细管电泳时代。 1983年Hjerten[6]将毛细管的内壁填充聚丙烯酰胺凝胶并将其用于毛细管电泳分离，发展了毛细管凝胶电泳(CGE)。CGE具有极高的分辨本领。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。 1984年Terabe等[7]将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支—胶束电动毛细管色谱(MECC)。他首次将表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)加入缓冲液中，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，目前，MEKC己成为应用非常广泛的电泳模式之一。1985年Hjerten[8]等把平板等电聚焦电泳过程转移到毛细管内进行，发展了等电聚焦毛细管电泳(CIEF)。他是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内[9]，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pH梯度，从而达到使复杂样品中各组分分离的目的。1987年，Karger等[10]对凝胶填充技术进行了改进，优化了CGE技术,极大提高了其分离效率并阐明了用小内径毛细管可进行毛细管凝胶电泳。同年Smith等[11]将毛细管通过电喷射接口与质谱相连，从而实现了质谱和毛细管电泳联用的检测法，毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术以其高效及高准确性被广泛应用于很多领域。 毛细管电泳根据分离机理和介质不同，具有多种分离模式，每种模式的选择性不同。毛细管电泳现有以下六种经典分离模式：毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)，CZE是毛细管电泳中应用最广泛的一种分离模式，CZE用以分析带电溶质，其分离机理是基
第五章 高效毛细管电泳分离技术
第五章高效毛细管电泳分离技术 第一节毛细管电泳技术发展简史及其特点 电泳是指带电粒子在电场作用下向电性相反的方向迁移的现象。据此对某些化学或生物化学组分进行分离的技术称为电泳技术。 从1930年瑞典科学家Arne Tiselius首次提出电泳法至今已有70年的历史。电泳法的发展大致可分为三个阶段。1950年以前属初创阶段，主要是界面移动自由电泳，一般在U型管内进行，无支持物。50年代至80年代中期出现了各种有支持物的电泳方法，如纸电泳、醋酸纤维电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，70年代后实现了仪器的自动化。80年代后期出现了毛细管电泳方法，实现了微型化、自动化、高效、快速分析，毛细管电泳技术已经成为同现代色谱技术相比的分析化学领域中的一个令人瞩目的分支。 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）或高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）是指以毛细管为分离室、以高压电场为驱动力的一类新型现代电泳技术。毛细管电泳仪的基本结构见图5-1。
HV（0-+30KV） 图1 毛细管电泳仪的结构图 C—毛细管；D—检测器；E—电极槽；HV—直流高压电源；Pt—铂电极；S—样品；DA—数据采集处理系统 完善的毛细管电泳仪应具备（1）有多种施压模式；（2）恒温精度高，恒温范围宽；（3）精确的进样控制；（4）检测器的灵敏度高等条件。 毛细管电泳分离技术用的是内径为5-100μm，外径为370μm，长为10-100cm的弹性熔融石英毛细管，毛细管的特点是（1）体积小；（2）散热快，可承受高电场；（3）可使用自由溶液、凝胶等为支持电解质，在溶液介质下可产生平面形状的电渗流。 毛细管电泳分离技术与传统的平板电泳和现代液相色谱分离技术相比具有很多优点：（1）高效（105-107理论塔板/米）；（2）快速（几十秒至几十分钟）；（3）分离模式多，选择自由度大；（4）分析对象广，从无机离子到整个细胞；（5）高度自动化；
毛细管电泳技术发展及应用前景
毛细管电泳技术发展及应用前景 毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），毛细管电泳方法虽新工艺，但历史悠久，它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术，是由1937年A. Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis, CZE）。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔片数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb到DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于80年代中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展最为迅速的领域之一。 毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在 pH>3的情况下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。目前已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。 毛细管电泳技术的分离模式和检测模式的发展同样也是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的进展，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳技术（ACE），芯片毛细管电泳（CCE），非水毛细管电泳技术（NACE）；本文作者尝试将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合进行基因检测，取得
PCR技术及原理
PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一、PCR反应成分： 1、模板DNA； 2、引物； 3、四种脱氧核糖核苷酸； 4、DNA聚合酶； 5、反应缓冲液、Mg2+等。 二、PCR反应基本步骤： 1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用
总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、 三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR反应条件的选择（影响因素） 温度参数： 1、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。 2、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。 循环数： PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律： 反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。
毛细管电泳发展历史
毛细管电泳的发展历史 中文摘要 本文简要的回顾了毛细管电泳的发展历史，对其发展和应用现状进行概述，并对未来的发展提出一些设想，作为我们研究课题的重点，特别对毛细管电泳安培检测技术进行了较为详细的评述。从电导检测、电位检测和安培检测的三种方法用于毛细管电泳这项分离技术的发展过程，到基础理论的研究、检测池的设计与改进、电极的改进及其应用的简单介绍到未来的发展动向等方向逐一涉及，一般的药物、氨基酸和糖类的分析到目前应用的热点进行了综述。从毛细管电泳安培检测技术需要进一步完善和发展考虑，提出了本论文的设想，在毛细管电泳安培检测的方法学研究及其在药物分析中的应用方面做出一些有意义的工作。 鉴于在毛细管电泳安培检测技术中，用于分离的高压电场对安培检测有着严重干扰，影响检测的灵敏度，而且分离毛细管与工作电极对接也存在一定困难等原因，前人已做了大量的研究工作，并提出了种种解决办法，但还存在不尽如人意的地方。在原有的工作基础上，我们进一步进行了毛细管电泳安培检测的研究工作，设计制作了一种高压电场隔离接口和相应的安培检测池，并对工作电极进行了改进，兹将主要研究内容报告如下：第一部分概述了毛细管电泳的发展历史，对电导检测、电位检测特别是安培检测的基本原理及其应用工作进行了详细介绍，指出了三种检测技术的优缺点，以及人们为降低噪音、提高检测度方面所做的一些工作，最后还简单介绍了本文的目的、意义和内容。 第二部分设计制作了一种电场隔离接口和安培检测池，并对检测电极做了进一步改进。对高压电场隔离接口的强度、稳定性、平衡时间、导电效率及隔离电场性能等进行了详细的研究。结果表明：该接口稳定，隔离电场效果好，可以满足实际工作的需要；制作的安培检测池可以解决分离毛细管与工作电极对接困难的问题，其工作电极可以方便的插入分离毛细管而不碰壁。组装了一套毛细管电泳安培检测系统，并利用该系统分离检测了三中种对苯二酚，结果令人满意。此外，我们通过对电极的改进，削弱了在毛细管电泳安培检测中存在的峰扩展现象，进一步提离了分离效率。 第三部分在自组装的毛细管电泳安培系统上，进行了毛细管电泳安培检测在药物分析中的方法学研究，建立了此种药物的毛细管电泳安培检测方法。 1. 用毛细管电泳安培检测法同时测定了银黄注射液中氯原酸与黄芩苷的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了较优化的实验条件。以直径为100μm的铜微电极为工作电极，于电极电位+0.8V(vs.Ag/Ag CI)处，40mmoI/L的Na2B407(pH值为13.4)min为缓冲溶液时, 氯原酸与黄苓苷在12min内得到良好的分离. 氯原酸与黄苓苷分别在5.0×10-3~0.5mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好的线性关系, 检测下限分别为1.0
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳-非接触式电导检测法的应用 ——瓶装矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+的分离检测 摘要本实验采用毛细管电泳–非接触式电导检测法，以8mmol?L-1Tris 和6mmol?L-1酒石酸为电泳运行液，分离电压为+15 kV，采用标准加入法，对瓶装矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+四种阳离子同时进行直接分离和检测。实验测得逸仙泉矿泉水中Na+、K+、Ca2+、Mg2+的含量分别为2.57mg·L1、13.46mg·L-1、4.99mg·L-1、1.82mg·L-1，发现K+、Mg2+含量均大大超出厂家提供的含量范围。 关键词高效毛细管电泳非接触电导检测法中大逸仙泉水分离检测标准加入法 1 引言 Na+、K+、Ca2+、Mg2+是人体内重要的无机阳离子，这些离子含量的高低直接影响人体的生理功能。Mg2+是人体细胞内的主要阳离子，浓集于线粒体中，是体内多种细胞基本生化反应的必需物质，在神经肌肉的机能正常运作、血糖转化等过程中扮演着重要角色。K+在人体内的主要作用是维持酸碱平衡，参与能量代谢以及维持神经肌肉的正常功能。人体中的钙元素主要以羟基磷酸钙晶体的形式存在于骨骼和牙齿中。Na+是细胞外液中带正电的主要离子，参与水的代谢，保证体内水的平衡，调节体内水分与渗透压，此外，糖代谢、氧的利用、维持正常血压也需要钠的参与。矿物质水中这些离子含量的高低决定了水质是否符合标准。因此，研究快速分离测定这些离子的含量很有实际的意义。 由于要同时测量四种离子含量，因此传统的对单一离子测量的方法不能用，毛细管电泳–非接触式电导检测法，可以同时对K+、Na+、Ca2+、Mg2+四种阳离子同时进行直接分离并且检测含量，相比已有的实验方法，本实验具有灵敏度高，操作简便，而且可以同时测定四种不同离子的含量，离子之间不存在相互干扰，极大地提高了实验效率，实验结果令人满意。 高效毛细管电泳的检测器中，非接触式电导检测（Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection, 简称C4D）是近年来发展起来一种新型的电导检测方法。非接触式电导检测法的电极与待测溶液隔离，避免了因电极与溶液接触而造成的诸多问题，有效地消除了电极中毒的问题，电极寿命长，抗干扰能力强，可检测物质的范围广。HPCE–C4D具有通用性好、灵敏高、分析成本低和环境友好的优点，在日常分析中具有广阔的应用前景。 2 实验部分 2.1仪器试剂
PCR技术的原理与方法
PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一.PCR反应成分： 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2 等。 二.PCR反应基本步骤： 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的
DNA以2n的形式增加。 ?PCR扩增的基本方法 ?PCR反应的成分和作用 总体积：一般为25μl～100 μl （一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。M
毛细管电泳技术及在微生物学中的应用
湖南农业大学研究生课程论文 学院：食品科技学院 年级专业：07级营养与食品卫生学 姓名：章沙沙学号：s200700294 课程论文题目：毛细管电泳技术及在微生物学中的应用课程名称：现代食品分析技术 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
毛细管电泳技术及在微生物学中的应用 学生:章沙沙 (07级食品科技学院营养与食品卫生学,学号s200700294) 摘要: 毛细管电泳技术是一种新型高效液相分离技术，应用领域广泛。本文分别从毛细管电泳技术的发展概况及在微生物学检测中的应用加以综述。 关键词: 毛细管电泳；微生物；应用 毛细管电泳迅速发展于80年代中后期,是分析科学中继高效液相色谱技术之后的又一重大进展，使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能[1]。毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。广泛应用于核酸、蛋白质、多肽、药物等大分子物质的分析，但是，不同于毛细管电泳在无机离子、有机小分子和生物大分子等方面取得的巨大成功，毛细管电泳在微生物方面的应用在最近几年才取得较大进展，并逐渐显现出巨大的应用潜力。在微生物学领域，毛细管电泳除了在微生物基因测序方面得到广泛应用外，在微生物学检测方面应用的报道不多见。本文主要介绍了毛细管电泳的发展、原理、特点、分离模式及在微生物检测中的应用。 1、毛细管电泳技术 1.1毛细管电泳发展历史 1937年瑞典化学家Tiselius[2]利用电泳技术第一次从人血清中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，并研制成第一台电泳仪，使电泳作为一种分离分析技术有了突破性的进展。经典电泳法最大的局限性在于存在焦耳热，只能在低电场强度下操作，直接影响了其分离效率和分析速度的提高，为了解决这一问题，人们进行了多方探索。1981年，Jorgenson和Lukacs[3]使用内径75um的石英毛细管进行电泳，成功地对丹酰化氨基酸进行了快速，高效分离获得了40万块/m理论塔板的高效率。这一开创性工作成为电泳发展史上一个里程碑，使经典的电泳技术发展为高效毛细管电泳（HPCE）。从此，毛细管电泳在理论研究，分离模式，商品仪器，应用领域等各方面获得了迅猛发展。如今，HPCE可与GC、HPLC相媲美，成为现代分离科学的重要组成部分[4]。 1.2毛细管电泳基本原理和分离模式 按毛细管内分离介质和分离原理的不同，毛细管电泳有以下几种分离模式[5]： (1)毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)的分离原理是基于各个分离物质的净电荷与其质量比(比荷)间的差异而进行物质的分离。迄今CZE仍是应用最多的模式，应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子等的分离。（2）毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE)是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳，不同体积的溶质分子在其分子筛作用的凝胶中得以分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核酸、DNA片段分离和测序及聚合酶链反应(PCR)产物的分析。（3）毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱(MECC)是采用表面活性剂在运动缓冲液内形成一疏水内核，外部带负电的动态胶束相，利用溶质具有不同的疏水性，在水相和胶束相间分配的差异进行分离。主要用于小分子、中性化合物和药物等的分离。（4）毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦(CIEF)是用两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种具
毛细管电泳原理及其应用
毛细管电泳原理及其应用 学院：海洋港口学院班级：14制药工程学号：1423014113 姓名：蒋佳丽时间：2015年1月7日 前言 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是近十几年来迅速发展起来的一种分离技术，虽说在上世纪六七十年代就有人对毛细管内电渗流形式做了理论探索并也开始尝试毛细管电泳技术，但都因为受到检测器灵敏度限制、电 泳过程中产生的焦耳热无法有效散失等因素的制约，影响分离效果。八十年代初，外壁涂有聚二酞亚胺，内径小于100}m 的熔融石英毛细管的使用[1]及检测器灵敏度的提高大大推动了毛细管电泳技术的发展，由于CE具有普通电泳和色谱 的优点及具有高效、高灵敏度、快速、低运行成本、犬信息量和易于自动化等特点，近年来在生物化学、临床诊断、 法医刑侦学等领域应用广泛。 一、CE设备及原理 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的淌度及分配上的行为差异而实现分离目的的一类液相分离技术。其仪器装置一般由以下几部分组成(见图一)1.高压电源;2.毛细管;3.在线检测器;4.电极及电极液;5.加样系统。毛细管是由熔融石英加工制成的(内径20一100}m，长度为20一100cm )，外壁涂有一层聚二酞亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可根据需要涂上一层高聚物。与平板凝胶电泳类似的， 毛细管内也可填充支持介质，如琼脂糖，聚丙烯酞胺及甲基纤维素等。 图一毛细管电泳仪装置示意图(Tagliaro, 1998)[1] 在线检测器位于距样品盘约三分之二至五分之四毛细管总长处，对毛细管壁内部进行光学聚焦(在此处的毛细管外 壁的保护层是被烧掉或刮去的，以利于光的通透)。在线检测器通常有紫外、荧光和激光等多种检测方式。对DNA的分析通常使用紫外检测，对200bp的DNA片段的最小检测浓度是O.5mg/L。但对于生物样品中在和许多其他成分共存的痕量物质测定时，或对特殊分析(如DNA序列测定)时就要使用激光诱导的荧光检测器(laser induced fluorescence, LIF)，使用LIF在非液相毛细管电泳中的检测灵敏度要比非激光诱导的荧光检测提高6倍[2]，比紫外检测高100倍。另外，加入染料EB还可改善分离度，能将碱基长度相同但序列不同的DNA片段分开[3]。 毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，带电粒子在电场作用下以不同速度向其所带电荷反方向迁移，当pH>3时，毛细管内壁的石英分子因玫Siq分子的解离，而在表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，形成一个双电层。在高电压作用下，双电层水合阳离子层引起整个溶液在毛细管中向负极方向移动，形成电 渗流。带电粒子在毛细管内的电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和，因此阳离子首先从负极流出;中性离子的速度等于电渗流速度，随后流出;而由于电渗流速度大于电泳速度，因此阴离子最后流出。 内壁石英分子除能造成电渗流外，还会吸附溶质中带正电荷的分子，从而影响分离效果。为了避免分析物被管壁 吸附，可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点，或者选用pH接近pH2.0，此时毛细管内壁无解离的负电荷，但在这种酸性环境下，蛋白质容易失活，一般仅用于多肤分析。有时也可对毛细管内壁进行涂层，如中性
简述PCR基本原理
一．简述PCR基本原理？ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 二．简述荧光定量PCR基本原理？ Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 ?荧光域值（threshold ）：是指PCR 反应的前15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold
?Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 三．简述PFGE优势用途？ 1.对细菌DNA进行酶切后的脉冲场电泳分析，在分子水平揭示细菌的指纹图谱。 2．可对不同年代和不同地区的菌株建立PFGE图谱数据库，对某种病原菌的流行趋势进行分析和预测。 3．不同实验室和国家不同菌毒株的比较分析，通过软件实现数据化和网络连接，用于传染源或污染源的追踪，快速控制疫情。