毛细管电泳技术在植物学研究中的应用

毛细管电泳技术在植物学研究中的应用

一、毛细管电泳在植物学研究领域中的应用

毛细管电泳在经过二十多载的发展和完善之后，目前已成为一种主流的分析技术手段，而被广泛地应用于研究、方法开发以及质量控制实验室而有其特定的位置，并且在不断加速地得予应用。毛细管电泳技术正在向着替代许多传统平板凝胶电泳技术、薄层层析技术、高效液相色谱技术等方向前进。据不完全统计，国际上已有近万台的毛细管电泳仪在各种实验室中运行着。目前，毛细管电泳技术已常规地应用于核酸、蛋白质、药物、糖类以及各种其它小分子、离子等的日常分析，尤其在碱性药物分析、手性分子拆分等更有其独特的应用。毛细管电泳技术与其它技术如激光诱导荧光检测技术、免疫分析技术、多级串联质谱、电化学检测技术等的联用也日趋活跃。食品的组成成分复杂,所以无论用GC 还是用HPLC 分析时,都要求对样品进行复杂的前处理,以免造成污染。高效毛细管电泳克服了HPLC 试验成本高,GC 应用面窄,TPLC 柱效低,重现性差,时间长的缺点。毛细管电泳在植物学研究中常见组分如无机离子、有机酸、碳水化合物、蛋白质、游离脂肪酸,以及食品添加剂与农药残留等方面有着广泛的应用。高效毛细管电泳以其样品处理简单、多组分可同时测定、快速、自动化及越来越低的检出限,被广泛应用在农业分析检测中。

在植物学研究中，被分析物通常是植物提取物等等，这些样品的组成成分复杂,所以无论用GC 还是用HPLC 分析时,都要求对样品进行复杂的前处理,以免造成污染。高效毛细管电泳克服了HPLC 试验成本高,GC 应用面窄,TPLC 柱效低,重现性差,时间长的缺点。毛细管电泳在食品成分如无机粒子、有机酸、碳水化合物、蛋白质、游离脂肪酸,以及食品添加剂与农药残留等方面有着广泛的应用。高效毛细管电泳以其样品处理简单、多组分可同时测定、快速、自动化及越来越低的检出限,被广泛应用在食品添加剂检测中。在1997 年的第48 届分析化学与应用光谱学会议上,HPCE 被列为食品分析、饮食安全检查等方面重点发展内容之一。

与通常的分析手段相比，毛细管电泳方法有以下的一些优势：

①清洗速度快，只要在测定样品间将毛细管充分冲洗,便可避免样品间的交叉干扰; ②较低的检出限完全满足国标的要求; ③由于HPLC 无法分析酸性防腐剂,所以不得不采用传统的滴定法,该法操作比较繁琐,而且误差很大,HPCE 成功地实现了对该类物质的分离测定,最低检出限可达 5 mg/ kg ,在国标中该类物质限量范围是50～450 mg/ kg ; ④HPCE 可用于毫无相关的混合添加剂的分离分析; ⑤HPCE 的一个显著特点是分析速度快，一般在几分钟内就可以完成分析。⑥样品的前处理要求很低，有些样品可以不需要前处理就可以进样分析。

1、各种农产品中蛋白质/多肽/氨基酸的分析

蛋白质是食品的一个重要组成部分，通过对蛋白质的测定，不仅可以从营养方面评价食品的价值，还可以研究食品在加工过程中的变化，或作为鉴定食品的依据。毛细管电泳技术比其他色谱技术更适合蛋白质分析，因为它有着非凡的分离效率和很低的分析成本。毛细管电泳应用于食品中蛋白质的分析已经有很多文献报道，Luguera采用毛细管凝胶电泳测定了葡萄酒在生产过程中蛋白质的变化，用以研究提高葡萄酒的质量；Recio用毛细管电泳研究了牛奶在高温处理过程中蛋白质的变化状况及耐热蛋白酶所产生的多肽；Kanning用毛细管电泳研究了母乳、牛乳、山羊乳中蛋白和多肽的构成，发现根据电泳图的特征可以判断乳的种类和是否掺假；也有文献报道用毛细管电泳分析谷物中的高分子量麦谷蛋白。氨基酸也是很多食品的营养成分，毛细管电泳可以同时对常见的20中氨基酸进行分析。

2、糖类及其缀合物的分析

天然产物中的糖种类繁多、结构复杂，常与蛋白、脂肪形成复合物。近年来，随着毛细管电泳技术的不断发展，各种新的糖衍生化反应和检测技术的发现，毛细管电泳已成为分析单糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖类化合物的有力武器。单糖的pKa值一般大于11，故需选用强碱性的缓冲液(pH>11)，使糖基上的羟基去质子而带负电荷，直接进行电泳分离，用紫外(195 nm)检测．也可以选用硼酸盐缓冲液，硼酸盐

与糖基络合形成带负电荷的络合物以进行电泳分离，用紫外检测．简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析．多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析。糖胺聚糖(GAG)类糖基的聚糖部分有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，一般都含有重复的二糖单元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，这些寡糖既带电荷又有紫外吸收(232 nm)，因此很适合用CE进行分析．另外CE 在糖型分析方面也取得了较大的成功。在糖的检测方面，紫外分析是最早用于CE进行糖类检测的，目前仍较多的被科研人员所采用。利用激光诱导荧光检测，对糖类进行柱前高效荧光标记，可使检出限达到10-9mol水平。

3、天然活性化合物-生物碱、酮、甙、酚酸的分析

生物碱是一类含氮的有机化合物，有似碱的性质，在低pH下荷正电，所以生物碱能用毛细管电泳在pH<7的缓冲溶液中得到分离分析。对于酚酸类化合物，在高pH下，不但酚酸上的羧基能离解，而且酚羟基也能部分离解，在电场的作用下实现分离。对于天然活性物质来说，毛细管电泳与HPLC、经典柱色谱等相比，分析速度更快，效果更好，条件更易于接受。

4、奶粉中的植物蛋白掺假检测

ISO 17129标准中规定了采用毛细管电泳的方法测定奶粉中是否含有大豆或豌豆蛋白等植物性蛋白的掺假。蛋白质由于其大分子的属性，分离分析并不是一个件很容易做到的事情，毛细管电泳相对来说是一个很有力的蛋白质分析手段。在ISO 17129标准中，无掺假的奶粉的毛细管电泳谱图与有植物性蛋白掺假的毛细管电泳谱图有很大的差异。国内多家单位，如伊利集团、蒙牛乳业、农业部乳品检测中心、农业部天津绿色食品认证中心也都在采用毛细管电泳方法来检测乳品中的各种蛋白质含量及掺假情况。

5、维生素、有机酸和阴离子的分析

维生素的测定方法很多，与传统的HPLC分析相比，毛细管电泳在Vc、尼克酸、

VB1、VB2、VB6、VB12、乳清酸、泛酸等维生素的分析方面有速度快，方法简单的

优势。目前报道的能够用毛细管电泳分析的有机酸有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、醋酸、乳酸等等。Devries用毛细管电泳同时检测了啤酒中的柠檬酸、苹果酸、醋酸、乳酸、琥珀酸、丙酮酸等几种有机酸；Cotter对酒中的氯离子和乳酸进行了分析；Oehole用毛细管电泳－间接紫外的方法测定了多种ppb级的有机酸和无机阴离子。

6、食品添加剂、生物毒素和抗生素检测

1．防腐剂可以对软饮料、酒、水果和果汁、人造黄油、果酱、干酪片、蔬菜、海产品等中存在的山梨酸、苯甲酸、乙酸、亚硫酸进行分析。

2．色素可以分析果汁饮料、冰淇淋、软饮料和乳品饮料中的赤鲜红、日落黄、胭脂红、朱红4R等很多中色素。

3．发色剂蔬菜、干酪、白菜、果汁及肉制品中的硝酸盐和亚硝酸盐

4．抗氧化剂芝麻油、葡萄酒和果汁中的BHQ、BHA、BHT、PG、葵酯、没石子酸、植酸等

5．生物毒素玉米中的黄曲霉毒素B1，果汁和酒中的棒曲霉素，埃希氏菌污染物的检测

6．抗生素残留动物组织或牛奶中的磺胺类抗生素药，牛奶中的氯霉素，鸡肉中的乙胺嘧啶、氟甲喹、恩诺沙星，鱼和鸡肉中的欧索林酸残留

7、食用油中的反型脂肪酸含量

反型脂肪酸可能是造成血管硬化的危险因素，也会提高血液中低密度胆固醇含量增加罹患心血管疾病的机会。

8、转基因食品的检测

有文献报道用于大豆、玉米等转基因食品的检测。

9、代谢组学研究

由于毛细管电泳的高分辨能力、低样品消耗以及众多可选择的分离模式，这一技术被用于代谢组学研究。

10、蛋白质翻译后修饰研究

很多基因表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。毛细管电泳对修饰水平不同的蛋白质isoform的分离和CE-MS和CE-LIF结合能够对翻译后修饰蛋白进行高灵敏度快速鉴定。