细胞工程学复习题

细胞工程学习题

1．诱导试管苗生根时，培养基的调整应

A．加大盐的浓度B．加活性炭

C．加大分裂素的浓度D．加大生长素的浓度

2．以下实验中可能获得三倍体植株的是

A．小麦的茎尖培养B．番茄花药培养

C．玉米胚乳培养D．玉米花粉培养

3．动物体各种类型的细胞中，具有最高全能性的细胞是

A．体细胞B．生殖细胞C．受精卵D．干细胞

4．以下哪个是植物离体培养常用的主要糖类

A．葡萄糖B．果糖C．麦芽糖D．蔗糖

5．农杆菌介导的转化方法主要适用于

A．草本植物B．木本植物C．单子叶植物D．双子叶植物

6．原生质体纯化步骤大致有如下几步：

①将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管慎重地吸去上清液。

②将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其他成分和酶液一样)，再次离心，去上清液，如此重复三次。

③将原生质体混合液经筛孔大小为40～100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。

④用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进展培养。一般原生质体的培养密度为104～106／ml。

正确的操作步骤是：〔〕

A ①②③④

B ②③①④

C ③①②④

D ③②①④

7．常用的细胞融合剂是

A．刀豆球蛋白B．聚乙二醇〔PEG〕C．细胞松弛素B D．脂质体

8．利用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体过程中，HAT培养基用来进展

A．细胞融合B．杂交瘤选择C．检测抗体D．动物免疫

9．以下过程中，没有发生膜融合的是

A．植物体细胞杂交B．受精过程

C．氧进入细胞中的线粒体D．单克隆抗体的产生

10．科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生

大量的单克隆抗体。与骨髓瘤细胞融合的是

A．经过免疫的B细胞B．没经过免疫的T细胞

C．经过免疫的T淋巴细胞D．没经过免疫的B淋巴细胞

二填空题

1、在植物组织培养基中，添加_____细胞分裂素_____ 能促进合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂与分化，促进芽的形成

2、在植物组织培养基中，添加_____肌醇_____ 能促进糖类物质的转化，也能促进愈伤组织的生长以及胚状体的形成

3、生长素是由__色氨酸_____通过一系列中间产物形成，在植物组织培养中生长素主要是用来刺激细胞的分裂和诱导根的分化，吲哚乙酸〔IAA〕、2、4-二氯苯养乙酸〔2、4-D〕、吲哚乙酸〔IAA〕、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸〔IBA〕等为类生长素。

4、细胞分裂素大多是__嘌呤_____的衍生物，在植物组织培养中细胞分裂素主要是用来______

5、生长素与细胞分裂素配比低有利于_芽_______的形成

6人工种子的构造: ______体细胞胚、人工种皮、人工胚乳__，在人工种子制作中，细胞培养初期参加细胞分裂抑制剂5-氨基尿嘧啶是为了满足_胚状体同步发育_______的要求

7植物次级代产物在培养系统中的积累会目标产物的合成具有反响抑制，可以采用流加培养________和两相培养_________工艺技术抑制

8 1923年法国科学家卡雷儿设计培养动物细胞的__卡式瓶_____，培养鸡心组织获得成功

三、名词解释

1．细胞工程细胞工程是指主要以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术

2．细胞工程包含哪几方面的容

植物快速繁殖②新物种培育③细胞工程生物制品④细胞疗法与组织修复

3．什么是植物组织培养，什么是植物细胞培养，为什么植物组织培养能够实现植物的大规模繁殖

植物组织培养是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。

植物细胞培养是在离体条件下，将别离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。〔植物组织培养目的，就是获得新的个体；植物细胞培养目的，就是获得大量的细胞。〕

①不受季节、地域、气候和有害生物影响，培养条件可控②遗传性状相对稳定，具有较稳定的次级代产物的合成能力

③分化程度高，可产生高度分化的细胞合成的次级代产物，例如根、叶中合成的代产物

④激素自养型，本钱低；生长速度快。注：外植体切割可以形成很多植株

4外植体

外植体主要指用于离体培养的植物或组织切段。一般来说，来源于生长活泼或生长潜力大的植物组织或器官的外植体更有利于诱导分化形成再生植株

5、器官发生途径与体细胞胚途径

器官发生途径：外植体诱导愈伤组织的形成，在激素的调控作用下，愈伤组织分化形成形态与功能不同的细胞，继而形成不同的器官，发育成完整的植株。(成熟细胞→愈伤组织→出根出芽→完整植株。植物的器官发生指在离体培养的组织或细胞团〔愈伤组织〕分化形成不定根、不定芽等器官的过程。)

体细胞胚发生途径：外植体诱导愈伤组织的形成，愈伤组织分散成单个细胞，单个细胞培养形成体细胞胚，体细胞胚促进胚胎发育形成再生植株。(成熟细胞→分生细胞→胚状体→完整植株。指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。)

6．玻璃化现象

植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗〞，

这种现象称为玻璃化现象，又称过度水化现象。

7、采用体外受精技术获得试管动物时，为什么要对精子进展体外获能技术处理

精子获能是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。雄性精液中含有“去能因子〞〔多是：糖蛋白〕，附在精子外表，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。去能因子的去除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力。主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，水解糖蛋白等“去能因子〞。

※增强精子活力，使精子具有在体外与卵子结合的能力〔精子获能〕并能发生顶体反响。精子获能在生育上具有重要意义，通过获能不仅增强了精子活力，而且关键是去除了精子外表的覆盖物，暴露出精子膜和卵子的结合位点，使精子具有发生顶体反响的能力。当精子遇上卵子时，精子头部的“顶体〞脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞到达受精的目的。

8、超排卵技术

超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。〔人工地使动物的激素水平到达阀值，诱发卵的成熟与排放〕

※为了获得足够的卵母细胞需要采用超数排卵技术。诱导家畜超数排卵需注射外源激素，其目的就是人工地使动物的激素水平到达阈值，从而诱发卵的成熟与排放。

9、在动物细胞核移植实验中为什么要对供核细胞进展饥饿培养

供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。别离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进展1～5天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止〞状态〔一般进入G0期〕。GO期细胞从生长方面看处于静止状态，在适宜刺激下，能被触发，从静止状态进入增殖状态。为核移植效率提供保证。

※因为体外培养得到正常二倍体体细胞系，通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。在5～10d将培养液中的血清浓度从10％逐渐减少到0.5％〔即血清饥饿法〕，造成营养缺乏，才能诱导细胞脱离正常周期而进入G0期，所以需对供核细胞进展饥饿培养。G0期细胞处于静止状态，在适宜的刺激下，细胞能被触发，从静止状态进入到增殖状态。

10、聚乙二醇诱导细胞融合的原理，为什么要对融合细胞筛选

(PEG的促融合机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生构造重排。)

聚乙二醇诱导细胞融合的原理：

①PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。②除了PEG的这种分子桥作用外，它可以改变膜的物理和化学性质，增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能，从而促进细胞融合。

对融合细胞筛选的原因：细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，别离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。

11．为什么动物的多倍体比植物的多倍体少

植物：〔1〕大多数植物是雌雄同体或雌雄同花的，它们的精原细胞和卵原细胞可能同时发生不正常的减数分裂，使配子中染色体数目不减半，这种配子通过自体受精而自然形成了多倍体。

〔2〕植物的繁殖比较容易，如果多倍体植物不能形成种子，它还能依靠营养器官的无性繁殖来产生后代，因此在生物进化过程中，植物多倍体有可能被保存下来。

动物：〔1〕高等动物的远源杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体。

〔2〕多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡，因此很难得到多倍体的子代个体。

7．为什么在植物细胞培养中，要采取看护培养技术处理单个细胞

因为初步得到的植物单细胞体外培养时增殖比较困难，需要设计特殊的培养方式提高培养效率。看护培养是用一块活泼生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。目的使单细胞恢复活力。具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是：简便、成功率高。〔缺点是不能在显微镜下直接观察。〕

8、植物细胞悬浮培养有哪些优点，通过植物细胞培养获取植物次级代产物，可以采用哪些方法提高次级代产物产量

①可以增加细胞与培养液的接触，促进营养的吸收。②保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果。③可以到达较高的细胞浓度，容易放大培养。提高次级代产物产量的方法：

为了提高次级代产物产量，首先要选育优良的细胞株，培养时保证培养基和培养条件符合细胞生长和代的需要。通过添加次级代产物的前体物质、诱导子等物质进展调控。还可以通过添加外表活性剂增加细胞膜的通透性。

9动物细胞贴附生长的过程？什么是微载体培养动物细胞，有什么优点，在此过程中如何接种

动物细胞贴附生长的过程：

①游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。由于细胞质的回缩，各种形状的细胞开场变圆。

②吸附期：多数细胞可在24h贴壁，血清中有促进细胞贴壁的糖蛋白，这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于载体外表，悬浮细胞再在吸附有促贴壁因子的载体上附着。③繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开场分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开场接触并连接成片。出现接触性抑制。

④退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代物的积累，密度抑制现象出现，细胞开场退化。如不及时传代培养，细胞会从瓶壁上脱落死亡。微载体培养动物细胞

微载体培养动物细胞的优点：贴壁，悬浮

①模拟了体三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长。

②很好地解决了生物反响器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。

③把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反响器。

④接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。接种方法：

球传球接种技术：将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体外表的技术。〔保证培养基和微载体处于稳定的pH与温度水平，

接种对数生长期细胞。不同的微载体所用浓度是不同的，常使用2～3g/L的微载体含量。搅动速度以50～70r/min为好。〕

10单克隆抗体技术中为什么要采用HAT培养基，如何获取人源化的单克隆抗体

①：因为HAT培养基中的氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，融合使用的瘤细胞一般是HGPRT和TK缺陷型，也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，瘤细胞〔未融合的与自身融合的〕因不能正常合成DNA而死亡。融合细胞具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞的HGPRT与TK，可采用补救途径合成DNA，因此可在HAT 培养中存活于繁殖，继而可筛选出杂交瘤细胞，获得单克隆抗体。②制备人源单克隆抗体的方法如下：A人-鼠杂交瘤单克隆抗体：用小鼠骨髓瘤细胞和来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞进展融合。

B人-人杂交瘤单克隆抗体：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体

C严重联合免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：SCID小鼠是由CB-17纯系小鼠16号染色体突变，使动物T、B淋巴细胞功能障碍导致联合免疫缺陷。免疫缺陷使动物可承受人体组织或器官移植，形成人-鼠嵌合体小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体，SCID小鼠实际上获得了人的免疫系统。这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，通过细胞融合制备抗体。D基因工程单克隆抗体：基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。基因工程技术可以获得完全人源化抗体。

四．简答题

1．简述毛状根培养获取次级代产物？

①毛状根是由发根农杆菌含有的Ri质粒引起的。将发根农杆菌含有的Ri质粒中的T-DNA片段整合到植物细胞的DNA上诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统，从毛状根中提取次生代产物。

②Ri质粒上vir区具有很高的保守性。在通常状态下vir区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香酮使vir区处于抑制状态的基因被激活，产生一系列限制性核酸切酶，在酶的切割作用下产生T-DNA 链，T-DNA进入植物细胞核，整合进植物细胞的基因组。T-DNA上有生长素合成基因tms1和tms2，指导IAA(吲哚乙酸〕的合成，在不需要添加外源生长激素的条件下，T-DNA在植物细胞中得到转录与翻译，刺激植物细胞形成毛状根，然后从毛状根中提取次生代产物。

2在转基因生物反响器构建中，请分析一种目标蛋白高效表达的策略

外源基因在宿主的大量扩增是目的蛋白高效表达的保证。氨甲蝶呤〔MTX〕是动物细胞关键代酶二氢叶酸复原酶〔ＤＨＦＲ〕的抑制剂，经过氨甲蝶呤处理后大多数细胞死亡，存活下来的细胞中dhrf基因得以扩增，提高二氢叶酸复原酶的表达水平，抵消氨甲蝶呤的抑制作用，与该基因相邻的染色体片段同样扩增。

①外源基因与dhrf基因拼接构建重组分子，转化源ＤＨＦＲ缺陷型的细胞系。

②dhrf缺陷型细胞一局部会接纳dhrf，另一局部不会接纳dhfr，接纳dhrf的细胞外源基因表达水平低。

③在不含核苷的培养基上进展筛选，只有含dhrf基因的细胞才能增殖，进而筛选得到接纳了dhrf的细胞。

④筛选得到的细胞，进而培养成一个克隆株。

⑤将其接种到含有0.05μmol/L氨甲蝶呤的培养基上进展筛选，大局部细胞死亡，少数细胞存活。

⑥培养一段时间后进展扩增，转移至0.25μmol/LMTX培养基中，MTX浓度提高，使得dhrf 大量扩增，外源基因也大量扩增，再转移至含0.25μmol/LMTX培养基中，培养一段时间后，细胞扩增。外源基因在细胞中高效表达。

根据成体干细胞外表标记物设计特异性结合物，荧光标记后利用流式细胞仪就可以别离获得干细胞。

①获得细胞外表标记物的抗体，与荧光标记物相结合。

②根据抗体抗原特异性相结合原理，带有外表标记物的细胞能与结合有荧光标记物的抗体结合，没有外表标记物的细胞不能与荧光物质相结合。

③荧光活化细胞进展分选：标记的细胞经小孔通过电场，经过激光的照射，荧光标记细

胞带负电，未标记细胞带正电，根据在电场中的偏移不一样，别离出所需的细胞

3．一个成功的悬浮细胞培养体系应满足什么样的条件？

生物反响器的设计原那么是尽量模拟培养物在生物体的生长环境。①采用对细胞无害和耐蚀材料制作，能耐受蒸汽灭菌。

②构造严密，壁光滑无死角，部附件尽量减少，严格保证无菌环境。③能提供均匀、理想的混合状态，保证良好的传质、传热效果。

④能准确地控制温度、酸碱度、溶氧度和CO2浓度等条件，有消泡装置，有可靠的参数检测和控制表仪并能与计算机联机。

⑤能够方便、快捷地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。⑥尽量节省能源消耗。