细胞工程复习题

细胞工程

如何正确区分正常细胞与凋亡细胞？P49

1、细胞培养的操作方式。P57

2、植物组织培养的优点。P75

植物无性繁殖过程中器官发生的方式。P74

3、植物组织培养的问题分析。P83

4、人工授精动物与体外受精动物有什么异同？P96/105

人工授精是动物受精方式的一种，比如鱼类和两栖类，精子和卵细胞的结合是在体外的人工授精是人为的取出动物（或人）的精子和卵细胞，在体外人工环境下完成精子和卵细胞的结合二者一个是自发的，一个是人为的人工授精的应用可以体现在多方面，比如近年来的试管婴儿技术；另外，人工授精在动物转基因上也有很多的的应用。

5、如何看待试管婴儿和体细胞克隆带来的伦理学问题？

与技术问题相比，人们更为担忧或恐慌的是克隆技术给传统的伦理道德、社会观念及价值体系带来的巨大冲击和挑战。

A、克隆人的法律地位和伦理关系难以确定。克隆人的出现，使世代的秩序和个人身份的确立出了问题。这种秩序和定位是构成人和社会关系的基本部分（如果产生了混乱，人和社会的意义将发生偏移）。另外，当克隆人在社会上与人相处时，由于其身份的特殊性，可能在心理上产生孤独感、恐惧感和绝望感，造成新的社会问题；

B、打破“哺乳动物不能无性繁殖”的自然规律，挑战传统的性伦理关系。千百年来，人类一直遵循着有性繁殖方式，而克隆这种“实验室里人为操纵下制造出生命”的方式，完全改变了人类自然的生育方式，从有性繁殖回到无性繁殖，人类繁殖后代的过程不再需要两性共同参与，这将对现有的社会关系、家庭结构造成难以承受的巨大冲击；

C、人类克隆技术可能破坏基因的多样性遗传机制。基因的多样性是物种得以进化适应环境的源泉所在，人类传统生育方式保证了不同基因组之；

D、从遗传学看，它破坏了人拥有独特基因型的权利。克隆技术使人类基因单一地遗传下去，导致人种退化，基因突变、新型病毒出现等一系列严重的问题。

7、.胚胎工程动物培育的关键技术环节有哪些？如何控制成功率？

关键技术环节有：体外受精、人工受精、核移植和胚胎移植四个环节；

控制成功率：要对各个环节技术的熟悉了解及掌握，即深化理论知识，对各个环节的相关技术、应注意的问题进行精细控制.

8、从培养基、培养方法、培养设备上比较分析植物细胞培养与微生物细胞培养的异同？

不同点:

,

的全能性。

植物细胞培养主要是获得新个体或细胞产品应用与快速繁殖试管苗、细胞产品、人工种子、转基因植物的培育等。动物细胞培养是获得大量新生细胞或细胞产品应用是获得细胞的产物

相同点:

条件。

9、分析讨论动物细胞生物制药的优点与存在问题？P236

10、举例说明动物细胞培养在生物制药中的应用。P235

11、干细胞研究的优点与存在的问题。P277

12、.简述胚胎干细胞体外培养的关键技术。P283、4

13、胚胎细胞克隆动物与体细胞克隆动物各有什么优势？

胚胎细胞克隆动物的优势有：⑴胚胎细胞分化程度较低，成功率较高；⑵可能一次性繁殖性状相同或高度相似的动物。

体细胞克隆动物的优势有；⑴体细胞数量丰富，易于获得；⑵被获取核供体的动物不受性别、年龄限制。

14、什么是试管动物？试管动物培育一般经过哪几个步骤？其繁殖技术的关键问题有哪些？

试管动物，也称体外受精动物，是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。

培育步骤：⑴精子采集与体外获能，卵子采集与成熟培养；⑵体外受精；⑶重组胚激活与体外培养；⑷胚胎移植；⑸体内发育、出生。

关键问题有：①精子的采集、获能和卵子的采集与成熟培养；②体外受精问题；③胚胎体外培养中的发育阻滞问题；④胚胎移植成活率低的问题；

15、脱毒植物的鉴定：

直接检测法（观察症状）、

指示植物法，指采用对某种病毒反应敏感、症状明显的植物来检测病毒

电镜法，用电子显微镜观察样品材料有无病毒存在，

抗血清检测法，病毒注射进动物体内，看是否会在血清中产生抗体得到抗血清

16、植物细胞融合的过程：

取材（生长旺盛、生命力强的组织）-----制备原生质体，即去除细胞壁，（机械去除法和生物酶解法）-----纯化原生质体（离心法、漂浮法等）-----诱导细胞融合（可以利用病毒、化学诱导剂促使细胞融合，或者采用的电融合诱导法）。

17、怎样获得植物的单倍体、三倍体和四倍体？

植物四倍体获得的方法：秋水仙素获得四倍体（调整秋水仙素浓度----处理分裂能力强的细胞）。

单倍体的获得方法是：花药和花粉培养，（取单核期未开放的花蕾，接种于适当的培养基中，再通过植株再生发育成单倍体植株）。

植物三倍体的方法：用以上获得四倍体的方法得到四倍你后，再以二倍体作父本，与四倍体母本植株杂交。

18、什么是植物细胞固定化培养，它有什么优点？

植物细胞固定化培养是将游离的细胞包埋在惰性支持物内部或贴附在它的表面多糖或多聚化合物置备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无菌培养的技术。

方法有：吸附、交联、共价结合和包埋等。

其优点有：①细胞包埋后所受剪切力损伤减小，维持了细胞稳定性；②细胞密度较高时不会改变培养液流体性质；③可将细胞生长与产物合成2个阶段分开；④细胞生长较缓慢，利于次生代谢产物积累；⑤增加细胞之间接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物合成；⑥固定化细胞可反复使用，可利于连续培养和收获产物，降低成本等优点。

19、什么是次级代谢产物，如何提高植物次级代谢产物？

次级代谢产物上通过次级代谢合成的产物，如抗生素、激素、生物碱、毒素等。

提高次级代谢产物产量需要考虑的因素有；A具体是选育优良的细胞株，B培养时保证培养基和培养条件符合细胞生长和代谢的需要，C添加次级代谢产物的前体物质进行调控，D添加表面活性剂增加细胞膜的通透性。

20、动物细胞大规模培养的方法有哪些？各自主要是为了解决什么问题？

动物细胞大规模培养的方法及其为了解决的问题是：⑴转瓶（管）培养系统，为了解决从小量培养到大规模培养的过度问题；⑵微载体培养，为摆脱传统的培养瓶（管）培养限制，实现三维立体贴附培养；⑶中空纤维生物反应器培养，为改善传统培养方法的气体、营养物质及水分等物质的通透性；⑷大规模培养方式，该法是为使细胞持续生长到较高的密度，目标产品达到较高水平。

21、原代培养取材时需要注意的几个问题是：①应选分化程度低、容易培养的组织，如胚胎、新生组织等；②注意使用新鲜材料和保鲜，取材后一般6h内分离细胞；③严格无菌；

④防止细胞机械损伤；⑤避免组织干燥。

动物细胞原代培养有组织块原代培养和细胞原代培养。

22、利用MS培养基配制植物组织培养培养基的方法及步骤（P45）

解：基本步骤：1，根据所需配置的培养基量，用移液管从装有MS母液的容器里吸取所需的母液量以及所需的6-BA0.5mg／L植物生长调节物质母液。注：不同的母液需要用不同的移液管吸取，切忌混用，以免母液被污染不纯 2，将吸取的母液依次注入量筒，注入蒸馏水定容 3，将电饭锅的电源插上,将溶液倒入，打开开关加温，并在适当的温度时分别加入蔗糖与琼脂，并用玻璃棒不断搅拌，使其均匀溶解。注：加入琼脂时，必须注意温度的掌握，不可过高。 4，在桌上将玻璃瓶按一定序列排好，将煮好的培养基均匀倒入，并且盖好瓶盖，贴上标签，写上培养基的名称。 5，将培养基放入高压灭菌锅后，拧紧，并加适量的水。打开开关工作后，先让温度上升至120℃，保持20分钟左右，温度开始下降，整体灭菌需要一段较长时间（一般为2个小时左右）。6，一段时间后，取出培养基，将那些瓶盖没盖好，已经感染的培养基处理掉。 7，做好一切后，打扫卫生，保持整体环境干净整洁

23、分析比较细胞培养不同操作方式的优缺点。

分批式培养方式的优点有操作简单，培养周期短，能直观反映细胞生长代谢过程，生产规模放大比较容易，其缺点有不能控制底物浓度、细胞容易老化、生长周期短、效率低等；流加式培养的优点有可合理充足补充营养、减少产物反馈抑制、排除有害代谢物积累对细胞的损伤及细胞不易老化，另外还能避免一次性投料过多，改善培养液流体性质，延长指数生长期，其缺点是操作较麻烦，受生物反应器容积的限制等；半连续式培养能使细胞持续指数生长，可多次收获并且操作简便，生产效率高，其缺点是菌种易老化；连续式培养可使细胞在恒定状态下生长，细胞生长速率可基本保持不变，持续指数增长，但其缺点是收获细胞浓度不高、细胞分裂快、易变异、易污染等；灌流式培养可维持较高的细胞密度，使细胞处于较稳定的营养环境中，有害代谢废物积累低，反应速率易控制，培养周期长，目标产品回收率高，其缺点是仪器设备要求较高，操作较复杂等。

7、植物组织培养的基本步骤及获得完整植株的途径

解：第一步，将采来的植物材料除去不用的部分

第二步是对材料的表面浸润灭菌

第三步是用灭菌剂处理植物离体快繁和脱毒技术

第四步把消毒过的外植体接到ms培养基上、在光照培养箱中进行培养、若要得到愈伤组织、则无需光照，直接进行暗培养

第五步愈伤组织的诱导、把形成的愈伤组织转接到生芽生根培养基上、进行再分化

第六步得试管苗、转种、得到完整植株

在无菌的情况下，将植物体内的某一部分器官或组织，如茎尖、芽尖、形成层、根尖、胚芽和茎的髓组织等从植物体上分离下来，放在适宜培养基上培养，经过一段时间的生长、分化最后长成一个完整的植株

11、简述植物激素的应用规律。

①先生长素处理，后细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不分化。

②先细胞分裂素处理，后生长素处理、细胞分裂也分化（可能是内源生长素起了作用）。

③生长素和细胞分裂素同时处理，分化频率提高。两者同时存在的用量比值可以改变形态建成的方向。生长素／细胞分裂素：比值高：有利根分化，抑制芽形成；比值低：有利芽分化，抑制根形成；比值适中：促进愈伤组织生长。

1、杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程？

原理：将杂交瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。这种技术称为杂交瘤技术。技术流程：

⑴动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备：一般要经过初次免疫、第二次免疫（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程，如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液⑵骨髓瘤细胞的获得与培养：骨髓细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。通常采用鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合细胞钱的两周就应开始附属骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。

⑶细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞，离心，弃上清。用PEG作用下，融合杂交瘤细胞。

⑷融合细胞的筛选：融合后的细胞类型：融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中存活5—7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：脾细胞+瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞，其中后两种需要进行特别的筛选去除。

⑸克隆化培养：将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一个孔中的细胞数在0至数个细胞之间。培养一段时间后去上清以ELISA法选出抗体高分泌性的抗体。找到针对目标抗原的抗体，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。

⑹分泌抗体的融合细胞的筛选：酶联免疫吸附法（ELISA）：主要是基于抗原或抗体能够吸附至固定相载体的表面并保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。

⑺单克隆抗体的大来那个生产：实体瘤法、腹水制备法、生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗。

7、何谓细胞工程？简述细胞工程的技术。细胞工程操作的主要对象有哪两大类细胞？

•细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程技术手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。

细胞工程的技术包括：细胞融合技术、细胞拆合技术、基因转移技术、细胞器移植技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术、染色体导入技术，从细胞结构的不同层次对细胞进行遗传操作。

细胞工程操作的主要对象有原核细胞如细菌、放射菌等细胞和真核细胞如酵母、动植物等细胞两大类。简述植物细胞的培养特性

（1）植物细胞较微生物细胞大得多，具有纤维素细胞壁。

（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染、需要用抗生素。

（3）在细胞生长的中期和对数期容易凝聚成直径达350-400um的团块，悬浮培养比较困难。（4）培养时需要供氧，培养液粘度较大，不能耐受强力通风搅拌。

（5）细胞具有群体效应、无锚地依赖性和接触抑制性。

（6）细胞培养产物多数滞留于细胞内，产量较低。

（7）培养过程具有结构、功能上的全能性

细胞工程

１.二级生物安全适用于处理什么材料，具体要求有哪些

答：适用于：（1）来自于来自于灵长类动物的材料和细胞系

(2)接触过灵长类的病毒或被其转化了的细胞系(3)含有支原体的细胞系。

要求：（1）所有可能产生气溶胶的操作都应使用垂直层流生物安全小室；（2）所有污染物都应放入装满蒸馏水的防漏的不锈钢桶中；（3）大的塑料器皿盖紧后放入高压消毒袋中进行高压消毒；（4）在处理或冲洗用过的器皿前，应先进行高压消毒；（5）进行操作时要带乳胶手套。

2.原生质体分离的方法有哪些，各有何优缺点（6分）

答：（1）机械法

优点：可避免酶制剂对原生质体的破坏。

缺点：获得完整原生质体的数量少，使用此法的植物种类有限。

（2）酶解法

优点：可获得大量原生质体，条件温和，原生质体完整性好，几乎所有植物都

可用此法。

缺点：影响原生质体的活力。

３.植物组织培养的基本步骤

答：（1）培养材料的采集（2）培养材料的消毒（3）制备外植体（4）接种和培养（5）

根的诱导

（6）组织苗的练苗移栽

4.细胞系和细胞株的鉴定指标及方法（8分）

答：鉴定指标：（1）纯度：分析以何种细胞为主，所占比例为多少，混杂有哪些其他细胞。（2）细胞生物学特征：细胞形态、结构、染色体组型、生长曲线、分裂指数、倍增时间是否与来源细胞一致。

（3）稳定性：传代过程中细胞学特征是否发生变化。（4）污染情况：检查是否有微生物或其他细胞系的污染。

鉴定方法：细胞形态学观察；绘制生长曲线，计算分裂指数；染色体组型和带型分析；

同工酶谱检测

4.植物细胞固定化的方法及特点

答：吸附法：利用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。

包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。

特点：（1）由于载体的保护作用，减小剪切力作用，提高细胞存活率和稳定性。（2）细胞束缚在一定空间内，不易聚集成团，促进代谢产物的分散。（3）可简便地在不同培养阶段更换不同的培养液。

（4）固定化植物细胞可连续反复使用，可缩短生产周期，提高生产效率。（5）容易与培养液分离，有利于产品的分离纯化，提高产品的质量。

植物单细胞培养的程序及各步中应注意的事项答：

1.建立细胞株

（1）材料准备

a.确定植物种类品种

b.选择单细胞或愈伤组织或叶肉、下胚轴等

c.借助酶处理：酶的种类、浓度、处理时间都对材料有一定影响

（2）制备细胞悬浮液a.培养基成分筛选

b.悬浮培养，振荡次数为80~90次/min

c.用200~300目钢网过滤盒离心沉降

2.选择细胞株平板筛选

a.细胞起始密度（0.5-2.5）*105个/ml

b.固体薄层培养基

c.按目标反复进行测定

3.扩大培养（或分化培养）（1）扩大培养（悬浮）（2）分化培养（固体）抗性分析（生化分析

4.鉴定分析

（1）扩大培养：鉴定提取：多次重复测定（生化分析）

（2）分化培养：植株再生

鉴定遗传分析：抗性测定、生化分析、遗传分析

1.利用固定化技术的优点为:

(1)反应器内细胞浓度高，代谢产物产率相应提高;(2)细胞可以长时间重复.使用;

(3)反应器结构简单，细胞抗剪切应力能力提高;

(4)细胞间接触良好，细胞分化适宜，有利于次生代谢产物的合成;(5)减少植物细胞的遗传不稳定性

2.大规模培养的特点:

（1）代谢产物的生产完全在人工控制条件下进行，可以通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物产量的代谢产物；（2）培养在无菌条件下进行，可排除病菌和虫害侵扰；

（3）可以进行特定的生物转化反应；（4）可以探索新的合成路线和获得新的有用物质等。

3.植物细胞的大规模培养技术:

悬浮细胞培养:机械搅拌式生物反应器气升循环式生物反应器旋转式生物反应器固定化培养植物器官培养

4.植物细胞大规模培养的影响因素:

1.外植体的选择

2.环境因子的影响:光、温、振荡频率

3.培养基的选择

5.细胞培养的现实意义：

生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹

症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。

临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等

5.培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。

原代培养(Primary Culture)期：特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织

在形态结构和功能活动上相似性大。

传代期：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型衰退期：特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

6.单克隆抗体的应用：

a.单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。

b.利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。

c.单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术

d.单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不

7.常用的杂种细胞筛选方法：

基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种

筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选

具有所需性状杂种细胞的筛选

8.什么是胚胎移植？有什么意义？

所谓胚胎移植（embryo transfer）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫

角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为“借腹怀胎”。

胚胎移植的意义：

①发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用；②缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；③长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的重要手段。

9.干细胞有几个主要特征：

干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限增殖分裂；

干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；

干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞

10.动物细胞大规模培养的方法

1.转瓶培养：培养过程中转瓶不断旋转，是细胞交替接触培养液和空气。

2.反应器贴壁培

养：细胞贴附于反应器内固定的表面生长。

特点：比较容易更换培养液，不需要特殊的分离和培养设备，但难以扩大规模。3.悬浮培养主要用于非贴壁依赖型细胞的培养

特点：成本较低，可连续收集部分细胞进行传代培养，传代时无需消化分散。4.固定化培养将细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养。

11.胚胎细胞的生物学特性、来源、培养、鉴定

ES细胞的生物学特性：1.细胞形态结构及核型2.细胞的高度分化潜能

3.碱性磷酸酶的表达

4.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达

ES细胞的来源:1.早期胚胎2.妊娠早期胎儿组织3.体细胞核移植ES细胞的培养： 1.饲养层细胞培养法

（1）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：能产生抑制ES细胞分化的白血病抑制因子（LIF）和促进ES细胞增殖

的细胞因子

（2）STO细胞：来自SIM小鼠胚胎（S），对硫代鸟嘌呤（A）和鸟苯苷（O）具有抗性的成纤维细胞系

2.无饲养层培养:

（1）基础培养液+500-1000IU/ml重组LIF（2）大鼠肝细胞条件培养基（3）大鼠心肌细胞条件培养基

ES细胞的鉴定:

--细胞的形态结构-核型分析--特异性标志分子的表达--分化能力检测--嵌合体的形成ES细胞研究的应用

1.ES系统已经成为基因功能研究的有效手段

2.ES细胞系建立后，可从最根本上揭示人及动物发育过程中的决定基因

3.ES细胞可作为评价新药及化学产品的毒性及效能的检测系统

4.ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源成体干细胞的生物学特征

(1)成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。

(2)成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。(3)成体干细胞是自我复制还是分化为功能细胞取决于所在的微环境和自身的功能状态。(4)成体干细胞没有确定的来源。

12.核移植技术的应用:1．制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；2．培育

优良畜种，扩大良种种群3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5．利

用核移植技术，研究生物学的基本问题。

13.目的基因的来源:

1.采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA 片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。

14.转基因动物的方法:

•反转录病毒法基因显微注射法胚胎干细胞移植法

15.正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：

通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。

负选择法筛选出特异整合型ES细胞：

如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，

这时用GCV筛选，tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。

16.反转录病毒载体的工作原理：

寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。

17.转基因动物在生命科学基础研究中的应用:

研究基因的结构与功能;研究基因的组织特异性表达;研究发育相关基因的表达与调控;克隆在发育

中起重要作用的基因;基因多级调节系统的研究;细胞功能研究

18.转基因动物在医药研究领域中的应用:

研究病毒性疾病;研究建立人类疾病的转基因动物模型;转基因动物与基因治疗;生产天然活性药物

蛋白

19.动物细胞的培养基主要哪几种？各有何特点？

主要分为天然，合成，无血清培养基。天然：营养成分丰富，培养效果好。成分复杂，个体差异大来源有限。合成优点：已知成分配制，培养条件一致,有利于定量研究代谢成分,便于细胞大量生产节省人力、物力,无潜在病毒污染.缺点：一般仍需要补充一定量的血清。由于血清中成分复杂且不稳定，给细胞产物的分离提取，激素，药物的作用机理研究，细胞对营养的确切需求等实验的设计和结果分析带来很多困难，而且血清只能过滤细菌，但过滤只能出去细菌，而不能出去血清中可能含有的病毒支原体，会干扰研究。无血清：优点：保证了实验结果的准确性，可重复性，稳定性，简化了提纯和鉴定细胞产物的程序，减少细胞污染，降低疫苗反应。缺点：成本太高，对试剂和水的纯度以及器皿的清洁程度要求也更高，针对性较强，一种无血清培养基一般只适用于一类细胞的培养等。

20.大规模培养动物细胞技术？目前哪些应用？问题？

1气升式培养系统2微载体培养系统3中空纤维培养系统4微囊培养系统应用：疫苗，干扰素，单克隆抗体，基因重组产品。存在问题：1细胞密度和产物浓度低2细胞群体在大规模、长时间的培养过程中分泌产物的能力易丢失，或产物的活性以降低3培养成本高，产品价格昂贵4对细胞代谢和生长特性的基础研究比较欠缺。5在线检测技术不完善，限制了优良培养系统的开发等。细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步

21.为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

22.干细胞分类：（1）按来源分类胚胎干细胞，成体干细胞（2）按分化潜能分类全能干细胞，多能

干细胞，单能干细胞

胚胎干细胞特点：具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身２００多种细胞类型。

干细胞共同特征：具有自我更新和不同程度的多向分化潜能，属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记，能无限地分裂、增殖，干细胞通过两种可能的方式增长，对称分裂和非对称分裂。胚胎干细胞：具有发育全能性，具有种系传递能力，能够形成嵌合体动物

干细胞的应用前景：探讨胚胎发育的调控机制，动物克隆及改良，细胞和基因治疗，组织工程的种子细胞来源，建立药物筛选和研究平台。

23.植物细胞培养和动物细胞培养技术的异同：

相似性基本上都是模拟体内的生长环境，提供良好的营养条件和物理环境，使活的组织细胞在体外无菌的条件下继续生长发育的过程。培养结果都是培养物在一定程度上表现出与在体内相似的生长行为。区别能进行离体培养的材料范围不同，所需的培养条件不同，生长形式不同。

24.HAT选择系统

HAT系统为次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞的特殊培养基。

细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成途径，另外一条是补救途径。

从头合成途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基蝶呤（A）可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成。

补救途径需要两种酶参与：一种是HGPRT酶（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），另一种是TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶）。他们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。在氨基蝶呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”来合成核苷酸。因此，一个HGTRP-或TK-的细胞株不可能在含有HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。

25.动物细胞融合的应用

1.用于树突状细胞抗肿瘤疫苗的研究

2.用于生产单克隆抗体

3.用于体细胞核移植和动物育种

4.用于细胞疗

法5.在基础理论研究方面的应用（1）用于基因定位和绘制人类基因图谱（2）用于揭示疾病发生的机制（3）用于遗传基因的缺陷互补研究（4）用于分化功能的表达调控研究（5）用于膜蛋白动力学研究

26.杂交瘤技术的基本原理即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术，就是将骨髓瘤细胞和B淋巴

细胞进行融合，得到可在培养基中长期快速生长的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，又具有骨髓瘤细胞在体外无限增殖的特点，可持续分泌成分单一的、具有高度特异性的单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。

27.胚胎融合的意义（1）可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力、性

分化机制与性比、胚胎细胞基因表达的机制；（2）可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；（3）可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；（4）可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；（5）利用种间移植，分析胎儿与母体的相互关系。

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