小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养
目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：
1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器
操作步骤
1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养
取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2）
2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。
分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。 骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消
小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
sd大鼠骨髓间充质干细胞培养流程 (1)
SD大鼠骨髓间充质干细胞培养流程 姓名：李静专业：血液内科学号：201210062 导师：赖永榕研究背景 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚层，是优质的种子细胞，亦是骨髓中存在的除造血干细胞外的另一类干细胞。由于取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。但是骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少，在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs 对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 研究目的 本实验通过BMSCs的黏附特性，应用全骨髓贴壁培养法，建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化BMSCs的方法，观察大鼠BMSCs的生物学特性，为后续利用BMSCs治疗血液疾病的研究提供稳定的干细胞模型。 一、实验材料与方法 （一）材料与试剂 生后30d的雄性SD大鼠，体质量100g，SPF级；DMEM培养基；青霉素、链霉素；胎牛血清；淋巴细胞分离液；0.25%胰蛋白酶；兔抗鼠CD34、CD44、 培养箱；倒置相差显微镜；SW-CJ 型生物洁CD45、CD105、CD90荧光抗体；CO 2 净工作台。 （二）方法 BMSCs的原代分离培养：2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的L-DMEM培养基冲出骨髓，反复吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液。将冲洗下来的液体制成单细胞悬液，经Percoll
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华] 很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。看来做小鼠MSC的战友越来越多。一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。 其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。 欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。 提纲 一，简版 主要步骤及操作要点。 二，完整版 1. 试剂及材料准备 2. 动物手术及取材 3. 原代细胞培养 4. 细胞传代 5. 讨论 时间关系，今天先给个简版。 我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹
1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器 2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶 3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代 4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢 5. 讨论:没经验 欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教 羽之无限版主,能有空再讲讲吗 这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代 真是天天盼着你啊 呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。 ……呵呵，跑题了。 我上周拍了一套取BMC的全过程照片，本来打算抽空上传的，可是……
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法 引言 充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。 原料与试剂准备 1.小鼠脐带组织 2.DM EM/F12培养基 3.胎牛血清（F BS） 4.细胞培养袋 5.1×PB S缓冲液 步骤 1.小鼠脐带的处理 （1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。 （2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。 （3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。 （4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。 （5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。 2.细胞的收获和培养
（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒 残渣。 （2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。 （3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。 （4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10% 的F BS。 （5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。 （6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。 3.细胞的传代与冻存 （1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓 冲液洗涤。 （2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。 （3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养 瓶中。 （4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。 4.脐带间充质干细胞的鉴定 （1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。 （2）选择适当的免疫标记物，如CD44，C D90，CD105和CD34等进 行细胞表面标记。 （3）根据免疫标记物的阳性率来评估细胞的纯度和有效性。 结论 小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的研究资源，在生物医学领域具有 广泛的应用前景。本文介绍了小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，从样品 处理、细胞的收获和培养、细胞的传代与冻存、以及细胞的鉴定等方面进 行了详细的介绍。希望这一方法能够帮助研究人员更好地利用小鼠脐间带 充质干细胞，推动生物医学的发展与进步。
间充质干细胞的使用流程
间充质干细胞的使用流程 引言 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，在医学 领域中具有广泛的应用前景。随着对MSCs的研究的不断深入，科学家们逐渐掌握 了MSCs的使用流程。本文将详细介绍间充质干细胞的使用流程，以便读者对该流 程有一个全面的了解。 正文 1.样本采集和处理 –从适当的供体中采集间充质干细胞的样本，例如骨髓、脐带血、脂肪组织等。 –样本采集后需要进行一系列的处理步骤，包括消毒、离心和去除红细胞等，以保证获得纯净的间充质干细胞。 2.细胞培养和扩增 –将处理过的间充质干细胞放入培养皿中，并加入适当的培养基。 –培养皿需要放置在恒温恒湿的培养箱中，提供适宜的温度和湿度。 –定期更换培养基，以提供营养物质和确保细胞的健康生长。 –细胞培养通常需要数天到数周的时间，细胞数量会逐渐增加。 3.细胞鉴定和筛选 –对培养的间充质干细胞进行鉴定和筛选，以保证其质量和纯度。 –常用的鉴定方法包括流式细胞术、免疫荧光染色等，可以检测细胞的表面标记物和特定的分子。 –筛选时需要排除可能含有附着细胞、坏死细胞或其他细胞类型的样品。 4.细胞存储和冻存 –对于细胞的长期保存和备用，必须进行细胞存储和冻存。 –使用液氮罐等低温储存设备，将间充质干细胞冻存于液氮中，通常在-196摄氏度。 –冻存细胞需要特殊的冻存液和方法，以确保细胞的生存率和功能。 5.向患者输注间充质干细胞 –在进行间充质干细胞的输注前，需要严格的安全筛查和评估。 –给予患者间充质干细胞通常采用静脉输注的方式，可以通过导管直接注入患者体内。
–输注后需要进行监测和观察，以确保患者的安全和疗效。 结论 间充质干细胞的使用流程是一个复杂而严谨的过程，需要专业的实验室条件和 设备。通过对间充质干细胞的采集、培养、鉴定、存储和输注等环节的科学操作，可以为临床治疗提供有效的细胞资源。然而，随着科学技术的不断发展，间充质干细胞的使用流程也在不断完善和改进，未来还有更多的创新和突破等待探索和发现。 以上就是间充质干细胞的使用流程的详细介绍，希望能为读者提供有用的信息 和参考。
骨髓间质干细胞分离培养的经验总结
骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。 一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。 布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤： （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞 （2）原代培养24h,48h各换液一次 （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来 （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。 （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。 （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。 菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。 天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养 骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养 准备工作 （1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。 （2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO） （3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。 实验前准备 （1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。 （2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。 （3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣，戴手套。用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。点燃酒精灯，安装吸管帽。 实验步骤 （1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
Balbc小鼠骨髓间质干细胞的复苏和培养
Balbc小鼠骨髓间质干细胞的复苏和培养 Balb/c小鼠骨髓间质干细胞的复苏和培养 1. 水浴锅37°C预热。 2. 准备好Balb/c小鼠骨髓间质干细胞完全培养基，温浴到37°C。 3. 取15 mL离心管中加入9 mL完全培养基。 4. 从液氮中取出冻存的骨髓间质干细胞，立即放入-80°C冰箱（目的是让进入冻存管 的液氮挥发）。 5. 在-80°C放置2~3 min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37°C温水中，快速晃 动使管中内含物尽快融化。仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。 注意： •1 尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险。 •2 要快速完成细胞复苏过程，融化过程时间过长，会造成复苏后的细胞活性较差。 •6. 用70%~75%的酒精擦拭消毒冻存管口的外壁。 CBPI0055A10 MUCMX-01001 Page 3 of 7 7. 在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液转移至装有9 mL完全培养基的15 mL离心管中。注意尽量避免产生气泡。 8. 为了减少细胞损失，再往冻存管中加入1 mL完全培养基，稍微吹打，收集至离心 管中。 9. 将细胞悬液经250 ×g（对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm）离心5 min。 10. 离心后尽量去除上清液，加入1~2 mL的完全培养基（已预热到37°C），轻轻吹打 混匀细胞沉淀。
11. 将细胞全部接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养器皿中，加入足量的完全培 养基。轻轻摇晃细胞培养器皿使细胞均匀分布。 12. 放入37°C、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。 13. 复苏后的第2天，给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基（已预热到37°C）。 14. 之后，每2天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%~90%的汇合度。 15. 当细胞达80%~90%的汇合度，进行消化传代。 注意：为避免反复温热培养基，如果在一次操作中无法用完整瓶培养基，建议分装到 适当的无菌容器中。换液时只取当天所需用量的培养基进行预热。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 赵继学;王广义;张海玉;伏鑫 【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3
小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法-上篇
大/小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法-上篇 二十世纪七十年代，Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞，呈梭形，可以进行体外克隆和多向分化，被称为CFU－Fs(colony－formingunitfibro-blasts)。随后，这种骨髓来源的基质细胞被进一步发现是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞，因其具有干细胞的部分特性，而被命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。 BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。 目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。下面就来教大家如何掌握这五种分离方法。 01 贴壁筛选法 贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。 利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。 操作步骤 01 以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar
大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织（图1-1），用含双抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔（图1-2）。 04 用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白（图1-3）。 05 收集骨髓液（图1-4），离心（图1-5），后加入适当培养基（含20%血清）（图1-6）接种于培养基皿（图1-7）中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养（图1-8）。 06 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。 图1 贴壁筛选法分离提取BMSCs 对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。不足的是分离提取的细胞纯度相对不高。 02 骨组织消化法 骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。 操作步骤 01 参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。 02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化。 03 消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。
小鼠造血干细胞制备
小鼠造血干细胞制备 引言： 造血干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞，可以不断产生各种血液细胞，包括红细胞、白细胞和血小板。研究小鼠造血干细胞制备的方法对于深入了解造血过程、治疗血液系统疾病以及开发新型治疗方法具有重要意义。 一、小鼠造血干细胞的来源 小鼠造血干细胞可以从多个来源获得，包括骨髓、外周血和胚胎等。其中，骨髓是最常用的来源之一，因为在骨髓中富含大量造血干细胞。此外，小鼠外周血中也存在一定数量的造血干细胞，可以通过采集外周血得到。另外，小鼠胚胎的早期阶段也含有造血干细胞，可以通过体外培养的方法获得。 二、小鼠造血干细胞的分离与富集 为了获得高纯度的小鼠造血干细胞，需要对细胞进行分离和富集。常用的方法包括密度梯度离心、免疫磁珠分离和流式细胞术等。密度梯度离心是一种通过调整细胞悬液的密度差异来分离细胞的方法，可以根据细胞的大小和密度将造血干细胞与其他细胞分离开来。免疫磁珠分离是利用特定抗体与细胞表面标记物的结合来选择性富集造血干细胞的方法，可以通过磁珠的吸附和洗脱实现对目标细胞的富集。流式细胞术结合特定抗体和荧光染料的使用，可以通过单个
细胞的流动和荧光信号来鉴定和富集造血干细胞。 三、小鼠造血干细胞的培养和扩增 获得小鼠造血干细胞后，需要进行培养和扩增，以满足后续实验的需要。常用的培养基包括DMEM/F12、RPMI 1640和Iscove's Modified Dulbecco's Medium等，其中添加适量的生长因子和细胞因子可以促进造血干细胞的增殖和分化。在培养过程中，需要注意细胞的密度和培养时间，避免细胞过度分化或过度增殖。 四、小鼠造血干细胞的分化和功能研究 小鼠造血干细胞可以通过不同的诱导因子和培养条件进行定向分化，得到不同类型的血液细胞。例如，添加EPO和SCF等因子可以促进红细胞的分化，添加GM-CSF和G-CSF等因子可以促进粒细胞的分化。通过研究小鼠造血干细胞的分化和功能，可以深入了解造血过程的调控机制以及与血液系统疾病的关联。 结论： 小鼠造血干细胞制备是研究造血过程和开发新型治疗方法的重要手段。通过选择合适的来源、分离富集、培养扩增和定向分化等步骤，可以获得高纯度的小鼠造血干细胞，并进一步开展相关的研究工作。希望通过不断深入的研究，能够为血液系统疾病的治疗和干细胞治疗的发展做出更大的贡献。
间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复苏 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 ? 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 ? 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 ? 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物
你了解大鼠骨髓间充质干细胞培养基吗？
你了解大鼠骨髓间充质干细胞培养基吗？ 大鼠骨髓间充质干细胞培养基是一种重要的细胞培养基，具有低pH值、营养丰富、易于消化等特点。通过合理选择和优化培养基成分，可以进一步促进干细胞的增殖和分化，为相关领域的研究和应用提供有力支持。 1、兼容性：培养基应与大鼠骨髓细胞具有良好的兼容性，以确保细胞在培养过程中能够正常生长和增殖。 2、低pH值：培养基的pH值应该保持在一定范围内，以促进干细胞的增殖和分化。 3、营养丰富：培养基应包含丰富的营养成分，以满足细胞生长和分化的需求。 4、易于消化：培养基中的生长因子和刺激剂应有助于促进干细胞的消化和贴壁。
大鼠骨髓间充质干细胞培养基的制备方法： 1、试剂与器材：高质量的胎牛血清、氨基酸、葡萄糖、核苷酸、维生素和其他生长因子等。 2、细胞培养：将干细胞与适量的细胞培养基混合，然后将细胞悬液接种到培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。 3、换液与传代：定期更换培养基，并在合适的时间进行细胞传代。 干细胞培养基的应用领域： 1、细胞移植：培养基可用于细胞移植，将细胞移植到患者体内，以促进受损组织的修复和再生。 2、基因编辑与药物筛选：培养基可用于基因编辑实验，通过基因编辑技术对细胞进行改造，以筛选出具有特定功能的细胞。 3、药物研究：培养基可用于药物研究，通过细胞培养观察药物对细胞的影响，为药物的研发和改进提供参考。 4、再生医学：培养基可应用于再生医学领域，如组织工程等，以实现受损组织的修复和再生。 随着生物技术的不断发展，大鼠骨髓间充质干细胞培养基的研究和应用将越来越广泛。未来，培养基的制备方法、稳定性、生物相容性等方面有望取得突破，为干细胞的研究和应用提供更加优质的细胞培养基。
成体小鼠骨髓中神经干细胞的分离与培养
成体小鼠骨髓中神经干细胞的分离与培养 过七根;陈付学;宋红生;庞淑亚;文铁桥 【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2003(031)006 【摘要】在无菌条件下抽取成体小鼠骨髓,在含体积分数1% B27,20 ng/mL EGF 和10 ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1) 培养基中,于37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度下常规培养,对培养的细胞进行nestin免疫荧光染色检测,并将pEGFP-N2基因在80 V、80 μs条件下采用电击法转化导入神经干细胞中.结果表明,培养7 d后,有大部分细胞聚集成团,并大量增殖;Nestin免疫荧光染色后呈阳性;导入pEGFP-N2基因的神经干细胞培养后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光.表明从成体小鼠获得的骨髓,在该试验培养条件下有神经干细胞生成,并且外源标记基因pEGFP-N2在其细胞中实现了表达. 【总页数】3页(P107-109) 【作者】过七根;陈付学;宋红生;庞淑亚;文铁桥 【作者单位】上海大学,生命科学学院,上海,200436;上海大学,生命科学学院,上海,200436;上海大学,生命科学学院,上海,200436;上海大学,生命科学学院,上 海,200436;上海大学,生命科学学院,上海,200436 【正文语种】中文 【中图分类】S814.8 【相关文献】
1.小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究[J], 陈黎红;程桦;闵军;吴木潮;严励;傅祖植 2.组织块法体外分离培养大鼠脊髓成体神经干细胞 [J], 张辉;张硕;江正;余涛;钟林;尹宗生 3.两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析 [J], 高建鹏;龙琼先;张志波;侯宗柳;王辉;余小鸣 4.胎鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养和鉴定:有向多种成体神经干细胞分化的潜能吗? [J], 贺月秋;陈惠金;钱龙华;陈冠仪 5.成体小鼠骨髓间充质干细胞的培养和纯化 [J], 肖承佐;章乐虹;张昊;贺勇 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
小鼠骨髓干细胞取样制备方法
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射
器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP 离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min， 染色期间每15min 混匀一次、
间充质干细胞
第1章间充质干细胞 1.1研究背景 自Evans等1981年首先建立了小鼠ES细胞系后，在此之后近20年内，人们相继自早期胚胎建立了猪、牛、兔、绵羊、由羊、水貂、仓鼠、灵长类动物(恒河猴、狨)和人类ES细胞系。最近，干细胞的研究又取得两个重大技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功，实现了人类胚胎干细胞体外的非分化增殖。同时对胚胎干细胞进行定向分化研究也取得了明显的进展，而且准确的分化诱导应用于干细胞治疗疾病。目前，胚胎干细胞在体外被诱导分化成的细胞类型越来越多，如Pacacios等利用某些骨髓基质细胞或其条件培养液，使胚胎干细胞在体外分化产生造血干细胞，并可进一步分化形成髓系造血细胞和淋巴细胞。 在干细胞研究中另一重大技术突破是成体间充质干细胞的横向分化的发现。一般认为，胚胎干细胞具有全能性，能分化为体内所有的组织和器官；而成体间充质干细胞的分化潜能较弱，只能分化成一种或有限的几种组织功能细胞。1999年，Jackson等用肌肉来源的间充质干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞。现在已有多家实验室证明人的间充质干细胞可分化为肝脏细胞、肌肉细胞、神经细胞等。这表明一种组织的特异性间充质干细胞可以横向分化成其他组织的细胞，间充质干细胞的横向分化具有明显的普遍性。成体间充质干细胞横向分化的发现不仅从理论上改写了“组织特异性间充质干细胞只能定向分化”的经典概念，而且为利用成体间充质干细胞治疗疾病提供了可能。有不少关于间充质干细胞定向诱导和横向分化的研究报道，造血干细胞向肝脏细胞以及其他细胞的横向分化在人类也已得到证实，为临床应用奠定基础。 1.2生物学特性 间充质干细胞[mesenchymal stem cells，MSC]是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具备干细胞的基本特性。在发育的不同阶段和特定环境条件下，间充质干细胞可向骨、软骨、肌肉、神经、血管及血液细胞等多种方向分化。在成体的很多器官和组织中也存在着间充质干细胞，以备修复和再生所用。间充质干细胞易于体外培养，扩增迅速，可以分化为多种