骨髓间质干细胞分离培养的经验总结
骨髓间充质干细胞经验总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离
目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1．直接培养法（全骨髓培养法）
1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：
（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞
（2）原代培养24h,48h各换液一次
（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来
（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。
（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。
（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。
菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。
天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。
2. 密度梯度离心法
裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。
菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1～2mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs，。
周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。
jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。
本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。
二、骨髓间充质干细胞的培养
天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。
分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。
三、骨髓间充质干细胞的特性
体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。
四、其他相关内容
Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。
参考文献
生理学报2003.55（2）：153－159
人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化
中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169
培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布
Exp Biol Med Vol. 226(6):507–520, 2001
Mesenchymal Stem Cells
NA TURE |VOL 418 | 4 JULY 2002
Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。 骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消
骨髓基质干细胞的分离与培养
骨髓基质干细胞的分离与培养 骨髓基质干细胞(BMSC)是最常见的成体干细胞，其操作流程比较稳定和成熟。即以BMSC为例，初步阐述成体干细胞具体应用步骤与流程。 (一)骨髓基质干细胞分离培养的准备工作 1.配制DMEM培养液 取DMEM培养基10g，NaHC03 2.2g，L-谷氨酰胺300mg，维生素C 37.5mg，青霉素10万单位，链霉素10万单位，加适量三蒸水充分溶解后，调节pH值至7.4，补三蒸水至900m1。经无菌0.22btm过滤器过滤后，加FBSl00ml，4℃保存。 2.配制胰蛋白酶-EDTA消化液 称取胰蛋白酶0.125g，EDTA 0.01 g，适量PBS充分溶解，调pH值至7.4，补三蒸水定容至100ml，0.22um过滤器过滤除菌，分装，4℃保存。 3.配制Percoll分离液 Percoll原液与1.5mol/LNaCl以9:1比例稀释。 4.配制成骨诱导培养液 DMEMlog/L，p-磷酸甘油钠10nmo/L，地塞米松10nmol/lL-a-磷酸抗坏血酸50btmol/L，L-谷氨酰胺300mg/L，l，25(OH)2-维生素D3 10nmol/L，10％胎牛血清。 5.配制成软骨细胞诱导培养液 DMEM 10g/L，地塞米松10 nmol/L，L-α-磷酸维生素C 50 umol/L，L谷氨酰胺300mg/L，TGF-βl 10ng/ml，IGFl00ug/ml，10％胎牛血清。 6.配制成脂肪细胞诱导液 DMEM 10g/L，10％FBS，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/m1，地塞米松 1mmol/m1，胰岛素10ug/m1，吲哚美辛100mmol/m1。 (二)骨髓基质干细胞的分离与培养 1.人骨髓的抽取 成年志愿者应无系统性疾病，年龄最好在20～40岁之间。所用器械预先用肝素润湿，10m1注射器吸人1ml肝素化PBS(1 000U/ml)。骨髓提供者仰卧位，髂前上棘常规消毒、铺巾，用2％利多卡因局部浸润麻醉，骨髓穿刺针垂直进入骨髓腔中，缓慢抽取2m1骨髓，立即注入15ml离心管中(如需骨髓量多，必须重新更换穿刺点，防止外周血造成骨髓稀释)。动物的骨髓穿刺过程基本相似。 2.BMSC的分离 采用密度梯度离心法。骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液，600g 离心5min，小心吸去上层悬浮脂肪。离心管中预置Percoll分离液，Percoll 原液比重1.13g/m1，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/m1。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入Percoll液面上，两者(骨髓：Percoll)体积为l：2；900g离心30min。可见离心管中液体分为5层，毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层，加入PBSloml，600g离心15rain，弃上清液获取有核细胞，细胞计数。以lXl0’/cm2密度接种于培养皿，加入10 m1低糖DMEM培养液，37℃,叵温，在5％C O2 、95％O2 混合气体环境中培养。 3.BMSC原代培养 原代细胞接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后2～5天换液。换液时先轻轻摇动培养皿，使未贴壁的红细胞浮起，吸除含大量红细胞的培养液，PBS洗涤2～3次。此时在低倍镜下可清楚地见到多
干细胞提取和分离方法总结
干细胞提取和分离方法总结 干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医 学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。 1. 胚胎干细胞提取和分离 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体 内所有的细胞类型。目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。 - 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。 - 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。 2. 间充质干细胞提取和分离 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织 等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种： - 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细 胞分离和纯化得到间充质干细胞。这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和 纯化得到间充质干细胞。相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。 3. 诱导多能干细胞提取和分离 诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。 - 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的 生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。细胞外基质法相对较简单，但效果较差。 - 转录因子法：该方法通过转染细胞的DNA，引导细胞在特定条件下分化为干 细胞。转录因子法的效果较好，但操作复杂且成本较高。 综合以上方法可以看出，不同类型的干细胞提取和分离方法各有优缺点。胚胎 干细胞的提取和分离方法受到伦理等因素的限制，但具有较高的分化潜能；间充质干细胞提取和分离方法相对简便，但提取的干细胞数量和质量有限；诱导多能干细胞提取和分离方法为重编程经济、无伦理争议，但成本和操作复杂。随着技术的不断发展，未来可能会出现更加高效和可行的干细胞提取和分离方法，进一步推动干细胞研究在再生医学领域的应用。
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定 间充质干细胞或间充质基质细胞（MSC）是可以从各种来源（包括骨髓，脂肪组织或脐带）分离的体细胞或成体干细胞。分离的MSC 是表现出位点特异性分化的成纤维细胞样细胞。MSC可能在体内再生受损或患病的组织，并可能在免疫调节中发挥作用，这为各种临床应用提供了基础。 1:缓冲液准备 1.1 PE（PBS+EDTA）缓冲液，用于分离单核细胞 用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2和2mM EDTA制备溶液。低温（2–8°C）保存。 ▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。 1.2 PBE(PBS+BSA+EDTA)缓冲液，用于分离CD271 +细胞。 准备包含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的溶液，用autoMACS®冲洗溶液以1:20的比例稀释MACS®BSA储备溶液，可得到pH 7.2、0.5％的牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA。低温（2-8°C）存放。 ▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。 BSA可以用其他蛋白质代替，例如相应的血清白蛋白，相应的血清或胎牛血清（FBS）。不建议使用含有Ca2 +或Mg2 +的缓冲液或培养基。 2：分选单核细胞 2.1梯度密度离心
2.2人骨髓单个核细胞(BM MNCs)的制备 ▲注意：仅使用新鲜骨髓。避免冷冻和解冻骨髓细胞，并在无菌条件下进行。 1.用针头从髂骨上嵴或胸骨采集骨髓。 2.用缓冲液以7：1的比例稀释抽吸的人骨髓，例：用5mL缓冲液稀释30mL的骨髓，最终体积为35mL。 3. 100µm过滤器过滤，去除骨碎片和细胞团。（▲注：使用前，先用缓冲液的润洗滤器。） 4.将35ml稀释的细胞悬浮液与15ml的Ficoll-Paque混合于50ml 圆锥形瓶中。 5. 445g，20°C，离心35min。 6．除去上清，吸取BM MNCs ,至新的50ml圆锥形瓶中。 7．加入40ml缓冲液洗涤细胞，在20°C 300g离心10min，弃上清液。 8. 为去除血小板，将细胞颗粒重新悬浮在50mL缓冲液中，20°C ，200×g离心10-15min，弃上清液。
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml
骨髓间质干细胞分离培养的经验总结
骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。 一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。 布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤： （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞 （2）原代培养24h,48h各换液一次 （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来 （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。 （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。 （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。 菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。 天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
大鼠骨髓间充质干细胞分离操作方法
大鼠骨髓间充质干细胞分离操作方法 （1）取SD大鼠（2周龄），颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。 （2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。 （3）从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。 （4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL 离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。 （5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。 （6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。 （7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。 （8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。 细胞形态 骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。
间充质干细胞贴壁培养实验报告
间充质干细胞贴壁培养实验报告 姓名：常琳学号：日期：2015/10/21 一、实验原理 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 骨髓中除有造血干细胞外，还存在着另一种间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）MSC形成于发育中的骨髓腔，个体出生之后，附于骨髓窦的内腔面，形成一种包埋于窦状网络中的三维细胞结构，这种细胞除具有分化功能之外，可像未分化细胞那样易体外扩增。MSC又是一种免疫缺陷的细胞，可抑制T淋巴细胞反应，有异体移植的可能。正是骨髓间充质干细胞有以上所述的不同于骨髓造血干细胞的特点，使得其分离取材方便、扩增迅速、可异体移植等，为组织细胞修复提供细胞来源。 间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。 二、实验材料 实验动物：SD大鼠，四周龄，雄性，体重80~100克 实验手术器械：解剖剪、解剖镊、止血钳、胶头滴管等 实验材料：清洗液（PBS和不含Ca+和Mg2+的HBSS）培养液DEME添加10%FBS 105IU/l青霉素和100mg/l链霉素；以及含有8%的（500IU/L）肝素钠的PBS 实验仪器：超净工作台、离心机 三、实验操作步骤 1.将SD大鼠处死后，浸泡于酒精中待用。 2.将后肢用碘酒和75%的酒精消毒后，减去后肢皮毛，用解剖剪剪下两侧 的股骨和胫骨 3.将两侧的股骨和胫骨浸泡于HBSS中，并在超净工作台上清除干净其上 的肌肉和韧带。并于HBSS清洗三次。 4.切除骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，将含有8%的（500IU/L）肝素钠的 PBS用10ml注射器注射于骨髓腔内，冲洗骨髓腔。 5.收集上述冲洗液，配平后离心（1000rpm ,8min） 6.用添加了15%的FBS、584g/ml的L-谷氨酰胺、105IU/L青霉素和100mg/l 链霉素的DEME培养液重悬细胞，以5×105个/ml的密度均匀接种到 25ml的玻璃培养瓶中。 7.将上述培养瓶做好标记后，放于37℃和5%的CO2的培养箱中培养 四、实验注意事项
实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离 实验准备： 器材:手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳,5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶 试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75µg/ml青霉素，50µg/ml硫酸链霉素） 1000iu/ml青链霉素的PBS(生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中) 无血清低糖DMEM。 2%台盼蓝染液 材料采集： 一,胎猪骨髓采集： 【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室. 2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织; 用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌 肉和骨膜,得到完整的股骨.立即用含有1。0ml DMEM+3000iu/ml肝素 的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再 加入等量培养液（DMEM+10％FBS)稀释，然后以1：4比例缓慢加入 到Percoll分离液（1。073g/ml）的表面，1000r/min 30min，小心吸取 乳白色的有核细胞层。 目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法 和贴壁筛选法。密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离 MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。Percoll密度梯度离心法 根据细胞密度不同将细胞分为数层,因此得到的MSCs纯度较高，但是 操作繁琐,而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度 梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活 性较强. 【13】来自：胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离 取2—3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青 链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS 冲洗3—4遍;用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射 器刺入处理好的股骨的一端,冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次, 使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞,100目滤沙过滤；1000rpm/min, 离心5min,用а—MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核 细胞的密度为1-2x107/ml。，然后接种培养。 二，新生小型猪骨髓采集： 【9】采取全骨髓培养法和密度梯度离心法进行pMSCs培养。根据动物体重，将幼猪麻醉。用10ml规格注射器抽取2ml肝素钠（200iu/ml）在无 菌条件下，抽取1日龄猪髂后上嵴骨髓10ml，取5ml在1500r/min离心 5min,细胞沉淀重悬在加入双抗的4ml生理盐水中，1500r/min离心5min, 最后细胞重悬在完全培养液（DMEM+15％FBS）中，将密度5x 104/cm2 的有核细胞接种到一次性塑料培养瓶中，置饱和湿度、37℃、5%CO2培 养箱中培养。另5ml加入15ml离心管中，加入5ml DMEM稀释后，缓 慢加于密度为1。077g/ml 5ml淋巴细胞分层液（天津TBD)上，1500r/min
人骨髓造血干细胞的分离培养
人骨髓造血干细胞的分离培养是一个复杂而重要的过程，涉及到细胞生物学、分子生物学和生物工程等多个领域。以下是对该过程的详细描述，共计800字。 一、分离骨髓造血干细胞 首先，我们需要从捐献者的骨髓中分离出造血干细胞。通常，捐献者需要接受全身麻醉，然后在医生的监督下抽取一定量的骨髓。抽取的骨髓样本经过处理后，会分离出造血干细胞和其他类型的细胞。这一过程通常需要使用到离心技术，如密度梯度离心法。 二、培养造血干细胞 分离出的造血干细胞需要在一个适合它们生长和分化的环境中进行培养。实验室环境通常需要具备以下几个条件： 1. 合适的营养物质：造血干细胞需要特定的营养物质来维持它们的生长和分化。这些营养物质包括氨基酸、葡萄糖、维生素、矿物质和生长因子等。 2. 适合的pH值和渗透压：造血干细胞对环境的pH值和渗透压非常敏感。过高的pH值或渗透压可能导致细胞死亡或停止生长。 3. 适合的温度：温度是影响细胞生长和分化的重要因素。适宜的温度可以使造血干细胞保持最佳的分裂状态。 在培养过程中，造血干细胞会逐渐分裂并形成更多的细胞，同时也会分化为不同类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。为了确保造血干细胞的生长和分化，通常会使用一些细胞因子，如集落刺激因子（CSF）和红细胞生成素（EPO）等。这些细胞因子可以刺激造血干细胞增殖并抑制其分化为非造血细胞。 三、观察和记录 在培养过程中，我们需要密切关注细胞的生长状况，并定期进行观察和记录。可以通过显微镜观察细胞的形态变化，测量细胞生长的速度和数量，以及检查细胞分化的程度。通过这些观察结果，我们可以了解细胞的生长状态，及时调整培养条件，以确保造血干细胞的最佳生长。 四、提取和分析干细胞克隆 当造血干细胞在适当的条件下生长和分化时，可能会形成独立的细胞克隆。这些克隆可以用于进一步的研究和药物开发。可以通过克隆培养、基因敲除、基因表达分析等方法对干细胞克隆进行深入研究。这些研究可以帮助我们更好地了解造血干细胞的生理特性，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。 总之，人骨髓造血干细胞的分离培养是一个涉及多个领域的重要过程。通过严格的实验操作和科学的观察记录，我们可以更好地了解造血干细胞的生长和分化机制，为相关疾病的治疗
小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法-上篇
大/小鼠骨髓间充质干细胞的分离方法-上篇 二十世纪七十年代，Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞，呈梭形，可以进行体外克隆和多向分化，被称为CFU－Fs(colony－formingunitfibro-blasts)。随后，这种骨髓来源的基质细胞被进一步发现是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞，因其具有干细胞的部分特性，而被命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。 BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。 目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。下面就来教大家如何掌握这五种分离方法。 01 贴壁筛选法 贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。 利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。 操作步骤 01 以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar
大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织（图1-1），用含双抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔（图1-2）。 04 用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白（图1-3）。 05 收集骨髓液（图1-4），离心（图1-5），后加入适当培养基（含20%血清）（图1-6）接种于培养基皿（图1-7）中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养（图1-8）。 06 24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。 图1 贴壁筛选法分离提取BMSCs 对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。不足的是分离提取的细胞纯度相对不高。 02 骨组织消化法 骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。 操作步骤 01 参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。 02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化。 03 消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。
干细胞提取和培养的操作技巧分享
干细胞提取和培养的操作技巧分享 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有重要的生物学和医学 研究价值。干细胞的提取和培养是干细胞研究的重要环节，操作技巧对于获得高质量的干细胞至关重要。在本文中，我将与大家分享一些干细胞提取和培养的操作技巧，希望能对广大科研工作者有所帮助。 一、干细胞的提取技巧 1. 选择合适的组织来源：干细胞的提取来源有很多种，如胚胎、胎盘、脐带血、骨髓等。在选择组织来源时，需要考虑到干细胞的种类与目标研究的需求，以及提取的难度和伦理道德问题等方面因素。 2. 提取方法的选择：干细胞的提取方法有多种，如机械分离、酶消化、磁珠分 离等。在选择提取方法时，需结合组织来源的特点和研究需求进行评估，并优化提取步骤以提高干细胞的纯度和活力。 3. 组织处理和细胞分离：对于一些组织样本，需要进行前处理步骤，如组织粉碎、胶原酶等酶消化处理。之后，通过离心等方式将细胞分离出来，将干细胞与其他细胞分离开来。 4. 干细胞单克隆的建立：在提取的细胞中，可以通过单克隆化方法建立纯种的 干细胞克隆。单克隆的建立有助于获得高质量的干细胞群体，为后续的研究提供可信的实验样本。 二、干细胞的培养技巧 1. 培养基的选择：干细胞的培养基的选择直接影响到细胞的生长和分化。不同 类型的干细胞具有不同的培养基需求，常用的培养基有无血清培养基（serum-free medium）、DMEM/F12培养基等。在选择培养基时，需综合考虑细胞的生长特性、细胞需求的添加物和研究目的等因素。
2. 培养条件的控制：干细胞的培养需要控制适宜的温度、湿度和气氛等条件。 常见的培养温度为37℃，湿度需要保持适宜的水分，而气氛通常是5%CO2和95%空气的混合气体。保持恰当的培养条件有助于干细胞的健康生长和维持干细胞状态。 3. 培养基和培养器具的消毒：在干细胞的培养过程中，保持培养基和培养器具 的无菌状态是非常重要的。所有使用的培养器具和培养基应经过严格的消毒处理，以防止有害细菌或真菌的污染。 4. 培养时间的把握：干细胞的培养时间需根据不同的研究目的和实验设计进行 把握。如果是进行干细胞自我更新的研究，需根据细胞的生长速率合理调整培养时间，并避免细胞的过度增殖或过度分化。 5. 细胞的传代：干细胞的传代是维持其较长时间培养的重要步骤。传代时需要 注意细胞的状态和密度，保持适当的细胞负荷，以免影响细胞的生长和分化能力。 三、干细胞的质量控制 1. 干细胞的表征与鉴定：为了确保培养的细胞为干细胞，需进行相应的表征与 鉴定。常见的鉴定方法包括免疫细胞化学染色、流式细胞术和基因表达分析等。通过这些方法可以检测干细胞特定标记物的表达情况，以验证细胞的干细胞特性。 2. 细胞的检测和分析：对于培养的干细胞来说，周期性地进行细胞的检测和分 析是非常重要的。通过细胞计数、细胞周期分析和细胞分化能力等测试，可以评估干细胞的生长状态和分化能力，并及时发现潜在的问题。 3. 污染的防控：干细胞培养过程中的细胞污染是常见的问题，包括细菌、真菌 和病毒等。因此，定期进行培养基和器具的无菌检测和细胞的污染检测是必不可少的，以确保干细胞的纯度和质量。 总结起来，干细胞的提取和培养是复杂而精细的操作过程，需要科学合理的技巧，以保证干细胞的纯度和活力。在本文中，我分享了一些干细胞提取和培养的操作技巧，希望能够对科研工作者和干细胞研究者提供参考和帮助。同时，做好干细
骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定
骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定 骨髓间充质干细胞是一类非常重要的细胞种类，它们具有广泛的应用前景，主要用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。然而，要在这些应用中实现骨髓间充质干细胞的有效利用，就必须先进行骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定，以保证获取的细胞具有较大的纯度和生物活性。 骨髓间充质干细胞的分离纯化 骨髓间充质干细胞的分离纯化方法主要包括直接培养法、贴壁法、悬浮式培养法等。其中，直接培养法是一种直接将骨髓细胞培养在培养皿中的方法，通过贴壁式培养，使不同种类的细胞在培养皿上生长，最终使骨髓间充质干细胞附着在培养皿底部，其他细胞则浮于培养液中，从而达到分离骨髓间充质干细胞的目的。贴壁法则是利用骨髓间充质干细胞具有较好的贴壁性质，将其分离于不贴壁的其他细胞种类中，一般会在6~8小时内附着于培养皿的底部，形成典型的纤维形状。悬浮式培养法则是将骨髓间充质干细胞分散在培养液中悬浮生长，并加入一些特定因子，使其在悬浮状态下生长和增殖，最终达到分离目的。 骨髓间充质干细胞的鉴定 骨髓间充质干细胞的鉴定是指对所分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定和确认。其主要包括形态学、生物学、遗传学和免疫学等多个方面的检测方法。形态学方面的检测方法主要是通过显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态、生长状态和细胞密度等指标进行判断。生物学方面的检测方法主要包括蛋白质组学、基因组学、代谢学等多个层面的检测指标，以确定其代谢状态、生长状态、分化能力和功能表达等信息。 骨髓间充质干细胞在临床应用中的应用前景 骨髓间充质干细胞广泛应用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。其中，在组织工程领域，骨髓间充质干细胞可用于修复或重建骨组织、肌肉组织、软骨组
间质干细胞的培养原理
间质干细胞的培养原理 间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可分化成多种组织细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。 间质干细胞最早是从骨髓中分离得到的，正常情况下，它在骨髓中的比例非常低，仅占单核细胞的1/105 ~1/104 。骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090 g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/ml，血小板为1.030~1.035 g/ml。为此利用一种密度介于1.075~1.092 g/ml之间而近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 在骨髓的原代培养物中，除了贴壁生长的成纤维细胞样的间质干细胞外，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的间质干细胞，必须除去其他细胞。根据其他细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去。对于贴壁的单核巨噬细胞，可根据其黏附能力的不同，通过调整Trypsin/EDTA 的消化时间，保证间质干细胞在短暂的作用时间内与塑料培养瓶壁分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁，从而使间质干细胞与其他的贴壁细胞得到分离。 在传代培养中，接种密度是影响体外培养间质干细胞增殖潜能的重要因素。低密度接种时，间质干细胞的增殖能力明显提高，而诱导细胞分化时则需要较高的细胞密度，这可能与分化时细胞与细胞间的相互作用有关。而在培养过程中，若细胞过度融合会促进其分化趋向，故要保持干细胞未分化状态，要及时传代。
干细胞培养全攻略
干细胞培养全攻略 第一步：准备工作 在开始干细胞培养之前，您需要准备一些实验室必需品，如无菌培养器皿、培养基、培养药品和设备。确保所有的培养物品都是无菌的，以防止任何细菌或真菌的污染。 第二步：细胞分离 从组织或器官中获得干细胞是干细胞培养的第一步。这通常需要对组织进行消化和分离，以获得细胞悬浮液。消化的方法因组织类型而异，可以使用酶来消化组织，如胰蛋白酶、胶原酶等。 第三步：培养细胞 将分离得到的细胞悬浮液培养在无菌培养器皿中。干细胞可以在不同类型的培养基中生长，包括含有营养物质的基础培养基和添加了细胞生长因子和分化因子的特定培养基。根据需要，可以选择不同的培养基来促进干细胞的增殖或分化。 第四步：细胞分化 干细胞具有自我更新和分化为任何类型细胞的潜能。要促使干细胞向特定细胞类型分化，可以通过添加特定的分化因子或调节细胞培养条件来实现。例如，如果要将干细胞分化为神经细胞，可以添加神经生长因子到培养基中。 第五步：细胞鉴定和纯化
在干细胞培养过程中，很重要的一步是对细胞进行鉴定和纯化。这可 以通过使用特定的标记物或抗体来检测细胞表面的分子标记完成。例如， 可以使用流式细胞术来分析细胞表面的特定蛋白，从而鉴定和纯化干细胞。 第六步：细胞传代 干细胞通常需要定期传代以维持其生长和增殖。细胞传代是将细胞从 旧的培养皿中收集，并将其移植到新的培养皿中的过程。在传代过程中， 确保培养基和设备的无菌性以防止细菌和真菌的污染。 总结 干细胞培养是一项复杂的技术，需要严格的实验操作和无菌技术。在 进行干细胞培养时，务必注意细胞的无菌性和培养条件的控制。同时，在 进行细胞分化和纯化时，要使用适当的试剂和方法来鉴定和纯化特定类型 的细胞。干细胞培养需要耐心和经验，但也为细胞生物学研究和医学应用 提供了巨大的潜力。
分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文
分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文 分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文 骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。 1 材料与方法 1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。 1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。 HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。