脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm，离心6min，弃上清。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX; 2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。 4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX; 5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。 7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。 8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml
bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞; 614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液 UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。15.细胞融合率到达80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。 二、细胞传代 1.观察细胞融合率在80%以上时，进行传代; 2.将培养瓶依此排好，取10~20瓶放入超净台，同时举行操纵。 3.依次倒去上清液(预留10~20 ml作终止液)，每瓶插手3 ml心理盐水，洗濯细胞后弃去;
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理 一、概述 脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。本文将就WJ-MSCs制备 原理进行详细介绍。 二、脐带间充质干细胞的来源 脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。在 脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。 三、WJ-MSCs制备方法 1. 脐带获取 制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。通常情况下，在新生 儿出生后不久即可进行采集。采集过程中需要注意消毒和无菌操作。 2. 分离WJ组织 将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ
组织。WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。 3. 制备单细胞悬液 将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。 4. 培养和扩增 将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。 5. 鉴定和纯化 经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定 和纯化。通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。 6. 冻存 经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。 四、WJ-MSCs的应用前景 WJ-MSCs具有广泛的应用前景。目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.360docs.net/doc/8419163970.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.360docs.net/doc/8419163970.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
脐带间充质干细胞制备存储标准
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质 干细胞制备存储标准非常重要。 脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面： 1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备 和存储过程中需要确保脐带的质量。取材时，应确保脐带来自经过筛 选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。 2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程 中的关键步骤。应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间 充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。 3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标， 以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。 5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。 在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。 脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法 引言 充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。 原料与试剂准备 1.小鼠脐带组织 2.DM EM/F12培养基 3.胎牛血清（F BS） 4.细胞培养袋 5.1×PB S缓冲液 步骤 1.小鼠脐带的处理 （1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。 （2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。 （3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。 （4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。 （5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。 2.细胞的收获和培养
（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒 残渣。 （2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。 （3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。 （4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10% 的F BS。 （5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。 （6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。 3.细胞的传代与冻存 （1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓 冲液洗涤。 （2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。 （3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养 瓶中。 （4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。 4.脐带间充质干细胞的鉴定 （1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。 （2）选择适当的免疫标记物，如CD44，C D90，CD105和CD34等进 行细胞表面标记。 （3）根据免疫标记物的阳性率来评估细胞的纯度和有效性。 结论 小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的研究资源，在生物医学领域具有 广泛的应用前景。本文介绍了小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，从样品 处理、细胞的收获和培养、细胞的传代与冻存、以及细胞的鉴定等方面进 行了详细的介绍。希望这一方法能够帮助研究人员更好地利用小鼠脐间带 充质干细胞，推动生物医学的发展与进步。
间充质干细胞的使用流程
间充质干细胞的使用流程 引言 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，在医学 领域中具有广泛的应用前景。随着对MSCs的研究的不断深入，科学家们逐渐掌握 了MSCs的使用流程。本文将详细介绍间充质干细胞的使用流程，以便读者对该流 程有一个全面的了解。 正文 1.样本采集和处理 –从适当的供体中采集间充质干细胞的样本，例如骨髓、脐带血、脂肪组织等。 –样本采集后需要进行一系列的处理步骤，包括消毒、离心和去除红细胞等，以保证获得纯净的间充质干细胞。 2.细胞培养和扩增 –将处理过的间充质干细胞放入培养皿中，并加入适当的培养基。 –培养皿需要放置在恒温恒湿的培养箱中，提供适宜的温度和湿度。 –定期更换培养基，以提供营养物质和确保细胞的健康生长。 –细胞培养通常需要数天到数周的时间，细胞数量会逐渐增加。 3.细胞鉴定和筛选 –对培养的间充质干细胞进行鉴定和筛选，以保证其质量和纯度。 –常用的鉴定方法包括流式细胞术、免疫荧光染色等，可以检测细胞的表面标记物和特定的分子。 –筛选时需要排除可能含有附着细胞、坏死细胞或其他细胞类型的样品。 4.细胞存储和冻存 –对于细胞的长期保存和备用，必须进行细胞存储和冻存。 –使用液氮罐等低温储存设备，将间充质干细胞冻存于液氮中，通常在-196摄氏度。 –冻存细胞需要特殊的冻存液和方法，以确保细胞的生存率和功能。 5.向患者输注间充质干细胞 –在进行间充质干细胞的输注前，需要严格的安全筛查和评估。 –给予患者间充质干细胞通常采用静脉输注的方式，可以通过导管直接注入患者体内。
–输注后需要进行监测和观察，以确保患者的安全和疗效。 结论 间充质干细胞的使用流程是一个复杂而严谨的过程，需要专业的实验室条件和 设备。通过对间充质干细胞的采集、培养、鉴定、存储和输注等环节的科学操作，可以为临床治疗提供有效的细胞资源。然而，随着科学技术的不断发展，间充质干细胞的使用流程也在不断完善和改进，未来还有更多的创新和突破等待探索和发现。 以上就是间充质干细胞的使用流程的详细介绍，希望能为读者提供有用的信息 和参考。
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理 导言 随着干细胞研究的不断深入，脐带间充质干细胞作为一种重要的干细胞资源，受到了广泛关注。本文将为大家介绍脐带间充质干细胞的制备原理，探讨其在生物医学领域的应用前景。 什么是脐带间充质干细胞 脐带间充质干细胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种存在于脐带Wharton’s jelly（韧带）中的间充质干细胞。它们具 有多能性，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。 脐带间充质干细胞的制备过程 脐带间充质干细胞的制备过程主要包括以下几个步骤： 步骤一：脐带收集和处理 1.选择健康的孕妇，并取得其同意，对脐带进行收集。 2.清洗脐带，去除表面的血液和细胞残留物。 3.将脐带剪成适当的大小，并用理化方法处理，以消除可能的微生物感染。 步骤二：组织析出 1.将处理后的脐带放入离心管中。 2.使用适当的消化酶（如胶原酶）进行组织的分解，使细胞从基质中解离出来。 3.离心管离心，获得细胞和基质的沉淀。 步骤三：细胞培养 1.用培养基悬浮细胞沉淀，并接种到培养器皿中。 2.提供适当的培养环境，如培养基、温度和湿度，以促进细胞的生长和增殖。 3.定期检查和观察细胞的形态和倍增情况。
步骤四：细胞鉴定和扩增 1.使用细胞表面标记物的抗体进行免疫细胞化学染色，以确定细胞的纯度和特 异性。 2.使用流式细胞术等技术，对细胞进行进一步的鉴定和排序。 3.如果需要，进行细胞扩增，以获取足够数量的干细胞用于后续的实验和应用。 脐带间充质干细胞的应用前景 脐带间充质干细胞具有以下几个优点，使其在生物医学领域有着广阔的应用前景： 优点一：丰富的源头 脐带是产妇和胎儿之间的纽带，获得脐带间充质干细胞不需要借助捐赠，因此更加容易获取，资源丰富。 优点二：低免疫原性 脐带间充质干细胞表面的HLA-ABC 分子表达较低，导致其具有较低的免疫原性， 在移植过程中不易被宿主免疫系统识别和攻击。 优点三：多向分化潜能 脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。因此可以在组织工程、再生医学和疾病治疗等方面得到广泛应用。 优点四：较少的伦理争议 相比胚胎干细胞的获取过程，脐带间充质干细胞的制备过程较为简单，且不涉及胚胎问题，因此较少引起伦理争议。 结论 脐带间充质干细胞作为一种重要的干细胞资源，其制备过程相对简单，具有丰富的源头、较低的免疫原性、多向分化潜能和较少的伦理争议等优势。因此，它在生物医学领域有着广阔的应用前景。未来的研究和探索将进一步推动脐带间充质干细胞的临床应用和转化医学的发展。
脐带血造血干细胞库技术规范
脐带血造血干细胞库技术规范(试行) I 脐带血造血干细胞库(简称脐带血库)的质量控制 1 规章制度和操作规程 脐带血库必须制定脐带血采集、制备、检测、库存、选择和发放的规章制度、操作规程。 1.1 脐带血供者筛选标准和咨询。 1.2 脐带血采集和运送。 1.3 脐带血制备、冷冻、库存。 1.4 标签。 1.5 传染性疾病、人类组织相容性抗原（HLA）分型、造血干细胞和其他检测。 1.6 库存脐带血和脐带血检测标本的确认。 1.7 脐带血的发放。 1.8 脐带血库与移植机构之间的运输。 1.9 数据管理、申请查询、供者与受者配型、脐带血的选择。 1.10 移植随访资料的收集和分析。 1.11 人员培训和继续教育。 1.12 材料、试剂和设备。 1.13 不合格产品、操作错误和事故的报告。 1.14 卫生清洁。 1.15 保密制度。 2 规章制度和操作规程的执行 2.1有脐带血库主任的签字及开始实施的日期。 2.2各项规章制度和操作规程修改，须由脐带血库主任或文件起草人进行审查、签字并标明日期。 2.3 规章制度和操作规程应置于方便工作人员随时取用的位置。 2.4 存档的各种规程和标准记录应长期保留。 2.5 如认为本技术规范不适应当前发展，允许各脐带血库根据情况适当调整，但应报脐带血造血干细胞库专家委员会备案，备案期为30天。专家委员会如不同意备案的规章制度和操作规程，应在备案期间内通知备案单位停止执行。 3 质量控制 3.1 应有专门的质量控制规程，以便对脐带血库工作人员在常规操作中所使用的规程、试剂、设备和材料进行质量控制。 3.2 脐带血库内部的质量控制 3.2.1应由脐带血库主任或指定专人进行质量控制。 3.2.2脐带血库内部的质量控制包括质量评估，改进和修正的措施，错误和事故的处理。 3.2.2.1 脐带血库必须有不合格产品的记录和报告。 3.2.2.2 脐带血库主任应定期召开质量评价会议，对错误和事故进行评价；对重大事故应及时处理。 3.2.2.3 脐带血库主任必须签发对规程的修正。
脐带间充质干细胞制备质量管理规范
脐带间充质干细胞制备质量管理规范 1 范围 本文件规定了脐带间充质干细胞制备过程和质量的要求。 本文件适用于以脐带为样本来源，通过脐带采集、制备、质量检验等步骤制成的脐带间充质干细胞全过程质量管理。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 18467 献血者健康检查要求 GB 50457 医药工业洁净厂房设计标准 GB 50346 生物安全实验室建筑技术规范 药品生产质量管理规范 中华人民共和国药典 全国临床检验操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 间充质干细胞 mesenchymal stem cell 一类存在于多种组织(如骨髓、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织和脐带血等），来源于发育早期的中胚层的成体干细胞，其贴壁生长，呈成纤维细胞样形态，体外具成骨、成脂肪和成软骨等分化潜能，具有免疫调控、造血支持和促血管新生等生物学特征。 外源因子 adventitious agent 系经无意中引入于接种物、细胞基质和（或）生产制品所用的原材料及制品中的、可复制或增殖的污染物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。 供体 donor 指提供器官、组织、细胞或基因等输送给另一个个体的生物。 采集 collection 从供体获得组织、细胞等生物样本的过程。 分离 separation 从供者器官或组织中分离出细胞的过程。 冻存 cryopreservation 是指经过程序降温冷冻，并利用深低温冷冻储存技术，以减少细胞代谢活动，保存细胞生物学活性。 复苏 thawing 细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的过程。 种子细胞库 seed cell bank 由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，通过检定证明适用于细胞制品生产。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于冻存管，保存于-150℃～-196℃。这些细胞经全面检定合格后，即可作为种子细胞库，用于工作细胞库或成品的制备。制备机构需限定种子细胞库的细胞代次。 工作细胞库 working cell bank
间充质干细胞贴壁培养实验报告
间充质干细胞贴壁培养实验报告 姓名：常琳学号：日期：2015/10/21 一、实验原理 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 骨髓中除有造血干细胞外，还存在着另一种间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）MSC形成于发育中的骨髓腔，个体出生之后，附于骨髓窦的内腔面，形成一种包埋于窦状网络中的三维细胞结构，这种细胞除具有分化功能之外，可像未分化细胞那样易体外扩增。MSC又是一种免疫缺陷的细胞，可抑制T淋巴细胞反应，有异体移植的可能。正是骨髓间充质干细胞有以上所述的不同于骨髓造血干细胞的特点，使得其分离取材方便、扩增迅速、可异体移植等，为组织细胞修复提供细胞来源。 间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。 二、实验材料 实验动物：SD大鼠，四周龄，雄性，体重80~100克 实验手术器械：解剖剪、解剖镊、止血钳、胶头滴管等 实验材料：清洗液（PBS和不含Ca+和Mg2+的HBSS）培养液DEME添加10%FBS 105IU/l青霉素和100mg/l链霉素；以及含有8%的（500IU/L）肝素钠的PBS 实验仪器：超净工作台、离心机 三、实验操作步骤 1.将SD大鼠处死后，浸泡于酒精中待用。 2.将后肢用碘酒和75%的酒精消毒后，减去后肢皮毛，用解剖剪剪下两侧 的股骨和胫骨 3.将两侧的股骨和胫骨浸泡于HBSS中，并在超净工作台上清除干净其上 的肌肉和韧带。并于HBSS清洗三次。 4.切除骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，将含有8%的（500IU/L）肝素钠的 PBS用10ml注射器注射于骨髓腔内，冲洗骨髓腔。 5.收集上述冲洗液，配平后离心（1000rpm ,8min） 6.用添加了15%的FBS、584g/ml的L-谷氨酰胺、105IU/L青霉素和100mg/l 链霉素的DEME培养液重悬细胞，以5×105个/ml的密度均匀接种到 25ml的玻璃培养瓶中。 7.将上述培养瓶做好标记后，放于37℃和5%的CO2的培养箱中培养 四、实验注意事项
干细胞产品工艺验证方案
脐带间充质干细胞产品工艺确认方案 方案起草人： 起草日期： 审核人： 审核日期： 方案批准人： 签名和日期：
确认方案 一、概述： 脐带间充质干细胞产品脐带间充质干细胞是剥离胎儿脐带后获得的华通氏胶，经过分离、培养扩增后获得的亚全能干细胞产品。可用于人体保健、再生医学领域等。 生产流程：分离---传代---冻存---复苏 二、确认目的： 本方案的目的在于为评价产品生产系统要素和生产过程中可能影响产品质量的各种生产工艺变量提供系统的确认确认计划，以保证实现在正常的生产条件下，生产出符合产品质量标准产品的目标。分析影响产品质量的关键因素，纠正偏差，建立生产全过程的运行标准和监控标准，确保产品质量安全有效、可控。脐带间充质干细胞产品是第一次在本公司生产，此确认方案的设计有助于证明脐带间充质干细胞产品生产过程的稳定性及生产系统的可靠性。 三、确认的基本原则 本次确认是在脐带间充质干细胞产品正常生产所需的厂房设施、生产设备、仪器仪表、检验设施设备及检验方法均经过了确认和校验、参与确认的相关人员都经过培训的前提下，按照批准的生产工艺规程和岗位SOP进行严格监控下的正常生产；所有记录真实、准确；所有检验严格按照批准的规程进行。 本次以编号的制备过程，确认整个流程符合要求，产品符合质量标准。四、确认准备 （一）成立确认组织： 1、成立确认领导组，确认组长、成员，明确职责。 2、成立若干确认工作小组，确认组长、成员，明确职责。 （二）、组织确认人员培训； （三）、检查和确认厂房与公用设施是否在确认周期内； （四）、检查和确认空气净化系统是否合格； （五）、检查和确认工艺用水系统是否合格； （六）、检查并确认生产设备是否合格； （七）、检查并确认计量器具是否合格；
脐带胎盘干细胞采集流程
资料范本 本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载 脐带胎盘干细胞采集流程 地点：__________________ 时间：__________________ 说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容
采集流程 采集用品 采集盒采集盒抗凝管 冰袋采集箱（内部）采集箱（内部）采集箱 4 采集 对已分娩的储户需要在采集胎盘时了解哪些情况？ 产妇的分娩方式：顺产还是剖宫产 产妇分娩的时间 新生儿的性别、体重 产妇分娩过程中有无羊水污浊、胎儿宫内窒息、胎儿外表畸形等异常情况 产妇分娩过程中有无药物使用史（催产素除外） 特别提醒： 选择顺产的胎盘污染的可能性有50%，剖宫产被污染的可能性大大降低； 羊水污染胎盘的可能性也很高 出现上述情况，胎盘很有可能无法保存，因此，你应详细记录这些情况给细胞生产车间以明确提示
采集 胎盘采集完毕，先别高兴，再做一次确认工作不是更好吗？ 胎盘是否完全浸没在采集液中，采集盒是否密封，有无漏液，有无破损； 《胎盘供者健康调查和胎盘采集登记表》是否填写完整； 冰袋是否保持冷冻状态，是否准备了4到6个冰袋； 将采集盒、采集登记表放在自封袋内后，再装入放有冰袋的运输箱或专用采集箱内 特别提醒：如果你是第一次采集胎盘，不要因为你的好奇或无知而做出以下行为 不要把采集后的胎盘在大庭广众之下展示，更不能打开采集盒，这样做既容易使胎盘被污染，也是对储户的不尊重； 不要把采集后的胎盘放在太阳下、温度过高处、紫外线及X光下，这样做胎盘很可能无法被分离，过高的温度或X光会加速细胞的死亡； 产妇生产可能在夜里，不要因为一时偷懒，人又储户自行保管胎盘，尽量在第一时间将胎盘交至物流人员手中或请医院帮助安全保存于冰箱的冷藏室内4℃； 不要忘记在第一时间通知物流人员，因为胎盘从采集到制备最多不能超过36小时； 运输 及时、正确的运输是确保胎盘能够正常保存的又一重要条件，虽然你不是专业的物流人员，但为了你的销售最终成功，请关注运输细节。
胎盘间充质干细胞的分离和培养
胎盘间充质干细胞的分离和培养 胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定 刘亭 2016.7.21 目录 前言 (2) 1分离制备PMSC组织的选取 (4) 2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7) 2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7) 2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8) 3 原代培养和继代培养 (13) 3-1培养基 (13) 3-2培养密度 (14) 3-3培养条件 (15) 3-4换液 (15) 3-5 传代培养 (16) 3-6细胞形态与生长速度 (16) 3-7 MSC的冻存与复苏： (16) 4细胞表面抗原检测 (17) 5生长曲线 (17) 6细胞周期 (17) 7分化潜能 (17) 参考文献 (17) 附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (19) 脐带血 (19) 脐带 (20) 羊膜 (22) 绒毛膜 (23)
蜕膜层 (24) 胎盘 (24) 整体灌注法 (26) 附件2 背景知识 (27) 附件3 PMSC实验所需试剂 (27) 前言 干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研 究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。 间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。 MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞。此外，一些研究学者还发现，MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。近年来MSC 已逐步成为干细
脐带间充质干细胞制备操作规程
1. 制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平■分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。 2. 换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，丁培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。 3. 传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2% FBS+a-MEM10ml,吸出细胞悬:液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm,离心6min,弃上活。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬:，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2X 14/ml，置37 C、5%CO2培养箱中培养。 4. 收获：每瓶加入3ml 0.25%胰酶，37C消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min,弃上活，细胞沉淀用16ml生理盐水悬:浮，混匀取1ml 做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500H 1上活做内蠹素检测， 1200rpm，离心6min。弃上活，离心沉淀用2.5ml FBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5X 10/ml 范围内。利用程序降温盒放置-80C医用冰箱中过夜后转至液氮罐。