狂犬病疫苗的发展现状

狂犬病疫苗的发展现状

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【关键词】狂犬病；病毒活疫苗；灭活疫苗

狂犬病（rabies），即疯狗病，又称恐水症（hydrophobia），是由狂犬病毒感染所致的损害中枢神经系统为主的急性传染病，属人兽共患的自然疫源性疾病。该病极为凶险，一旦发病，病死率100%［1～2］。全世界每年约有3.5～5万人死于狂犬病［3］，其中99%的病例发生在发展中国家，亚洲约占发病总数的56%，而非洲约占44%［1］。2009年7月16日据参考消息报道，中国2007年由狂犬病引发的死亡人数上升至3300人。当前控制狂犬病是当务之急，应采取“管、免、灭”为主的综合性防治措施。目前应用狂犬病疫苗接种是预防狂犬病的有效方法。本文就狂犬病疫苗的发展、国内外主要疫苗使用情况及新型疫苗的进展作一综述。

疫苗的研制与改进创新

100多年来，全世界应用固定毒种发展了多种人用狂犬病疫苗，由最初的神经组织疫苗到现代的细胞培养疫苗。神经组织疫苗接种反应大，免疫原性低。现代疫苗接种剂量及针次少，接种反应低，

免疫效果不断提高。纵观疫苗的发展，1882年巴斯德（Pasteur）从牛脑分离到一株狂犬病病毒，将其在家兔脑内连续传90代。该病毒传代至50代时的潜伏期已由原来的15天缩短为固定的7天，并且毒力也减弱，称为固定毒［4］。将感染后7天发病的兔脊髓取出，在室温空气中干燥，后发现病毒的毒力很快降低，一般干燥15天后可完全减弱。1885年，巴斯德首次对一名被疯狗严重咬伤60小时后的9岁男孩腹部皮下注射神经组织疫苗，连续注射13针，结果该小孩获得了免疫保护。巴斯德这一成功的预防和治疗狂犬病的方法开创了人用狂犬病疫苗的新纪元，引起了医学界的极大重视。此后许多国家对狂犬病疫苗的研制方法进行了许多次改进和创新，主要有：①减毒活疫苗：1887年由匈牙利Hoegyes研制，即将固定毒以稀释法降低毒力。一般开始免疫时，病毒以1/10000稀释，最后以1/100稀释，持续免疫2～3周。这一方法曾在一些国家广泛使用，并证明效果良好。

②灭活疫苗：1911年由在印度的英国人Semple首创，即将感染的固定毒的羊脑组织研制疫苗。该疫苗主要在非洲和亚洲使用，并一直沿用到20世纪50年代。由于用羊脑研制的疫苗接种反应严重，一般注射14～21针，到20世纪70年代末逐渐被细胞培养疫苗所替代。我国自1949年起，一直使用羊脑研制有的Semple疫苗，1980年停止使用，由原代地鼠肾细胞疫苗取代［5］。国外主要疫苗使用概况为提高疫苗的有效性，减少注射针次、剂量和简化免疫程序，降低不良反应，各国开始研究细胞培养疫苗，目前研制成功各种细胞培养疫苗，并不断改进和提高，得到广泛应用的有如下几种：①人二倍体细胞疫

苗（HDCV）：该疫苗于20世纪60年代早期由美国Wistar研制所Wiktor等人研制成功［6］，用人二倍体细胞WI38株适应和培养病毒研制疫苗。目前主要由法国、德国生产，仅在美国、欧洲等发达国家使用。该疫苗安全有效，注射针次少，被认为是一种好的疫苗［7］。但该疫苗制备较困难，价格昂贵，难以推广。②原代地鼠肾细胞疫苗（PHKCV）：加拿大最早于1958年进行该疫苗研制［8］，前苏联用适应于原代地鼠肾细胞上的Vnukovo32株制备冻干疫苗，并已广泛用于前苏联和东欧的许多国家。经大量试验研究和人群观察，证明其安全有效［9］。我国也于1980年研制成功并开始大量生产和应用，取代了脑组织疫苗［5］。③精制鸡胚细胞疫苗（PCECV）：1965年日本Kondo将Flury HEP株病毒适应在鸡胚细胞培养，用鸡胚细胞培养病毒,经β丙内脂灭活后而制成灭活疫苗。该疫苗免疫后获得良好的中和抗体应答，效果达到或超过人二倍体细胞疫苗［10～11］。但该疫苗在世界上其他国家用量较少。④提纯的Vero细胞疫苗（PVRV）由法国Mrieux研究所研究成功，用微载体悬浮培养的Vero 细胞生产狂犬病疫苗，其优点为短期内可繁殖大量细胞并可进行工业化的大罐培养，所用的毒种为与生产HDCV毒种相同的PM 15033M 株。该疫苗具有安全和高免疫原性，用于暴露后免疫接种的保护效果显著。由于该疫苗可进行工业化大规模生产，产量大，便于浓缩精制，生产方便，价格便宜，仅为HDCV的38.7%［12］，已在世界许多国家广泛应用。⑤提纯的鸭胚疫苗（PDEV）由瑞士血清疫苗研究所研究成功的一种纯化鸭胚疫苗，系将狂犬病毒PM株在鸭胚内连续传代的

适应株作为毒种，用鸭胚培养病毒制备疫苗。该疫苗经人群试验，效果与HDCV相似［6］，1980年获准生产，到1991年生产200万剂量，其中10%在欧洲国家使用，90%出口到其他国家［1］。⑥原代牛肾细胞疫苗（FBKCV）：由法国巴斯德研究所研究成功，系将狂犬病毒PV11株适应在胎牛肾原代细胞培养31代作为毒种，用胎牛肾原代细胞培养病毒制备疫苗。该疫苗在法国已获准用于暴露后人群的免疫接种，试验观察免疫后14天中和抗体阳转率达89.4%［1］，认为具有较高保护力，但尚未大量生产和使用。

国内疫苗研制与免疫效果

我国于1980年以前均生产羊脑制备的疫苗，生产用的毒种为北京株固定毒。为解决人用脑组织疫苗接种后的神经系统合并症和效价低的问题，我国于1980年研制成功原代地鼠肾细胞培养疫苗，近年来又研制成功Vero细胞培养疫苗［13］。

1.原代地鼠肾细胞培养疫苗（PHKCV）

我国的地鼠肾细胞疫苗于1965年由卫生部武汉生物制品研究所牵头，卫生部长春、兰州生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位合作开始研制，经过多年的研究培育出aG株，至1979年研制成功并获准生产。该疫苗所用毒种为北京株兔脑固定毒在原代地鼠肾细胞中连续传至50～60代适应所得。再经豚鼠脑和原代地鼠肾细胞交替传代3代的毒株，用豚鼠脑作为生产毒种。病毒在原代地鼠肾细胞上生长稳定后称之为“aG”株。该疫苗的安全性和免疫性高，可用于狂犬病的预防和治疗。广西1981年开始全面使用地鼠肾细胞疫苗，

按常规免疫程序进行感染前和感染后的预防，有较好的预防效果，人狂犬病发病率明显下降，对广西玉林、博白等县部分抽样调查可见，该疫苗的保护率在86.0%以上［14］。但大量使用后发现有部分接种疫苗仍有发病的病例，其中一部分为早死病例，另一部分为疫苗无效病例［1，4，14］。无效病例的存在，研究者认为与狂犬病疫苗抗原的差异、免疫程序、疫苗抗原量不足及个体差异等因素有关［14］。该疫苗产生抗体较晚，对严重咬伤或发病潜伏期短者不能给予保护，认为应提高抗原量和增加疫苗的稳定性，以提高免疫效果［14］。

2.纯化Vero细胞疫苗（PVRV）

近年来我国已研制成功以Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗。Vero细胞从美国ATCC引进，经全面检定，符合要求后提供给厂家，细胞代次为126～134代。生产企业获得细胞后按要求进行全面检定，建立种子细胞库和生产用细胞库。用于生产Vero细胞疫苗的毒种，经国家药品监督管理局批准的有两株，一株为生产地鼠肾细胞疫苗的aG株，另一株为CTN1株，由中国药品生物制品检定所建株和保存。CTN1株源自于1957年分离自山东省淄博市死于狂犬病病人脑组织，命名为济南571（即CTN571）,也就是济南1957年1号株狂犬病街毒，经小鼠脑内连续传5～6代后证实狂犬病固定毒。CTN1毒种容易在Vero细胞传代适应，早代病毒滴度达105.0/ml以上，传10代后病毒繁殖高峰缩短，Vero细胞适应10代以后的毒种适宜于制备Vero细胞疫苗［15］。小鼠试验证明CTN1制备的疫苗对国内分离的狂犬病街毒（SBDO7株）具有良好的保护作用，脑内或肌内攻击

保护效果可达到88.9%和90.0%，表明CTN1株具有较高的免疫原性，适用于狂犬病疫苗的生产［16］。近年来辽宁成大生物制品有限公司［17］引进国外的巴斯德PV毒种和生产技术，利用生物反应器，以每升25 g的高密度微载体灌流式法，收取病毒液的细胞培养技术并研制成功无佐剂Vero细胞疫苗。该疫苗与法国生产的Vero疫苗比较，两种疫苗均未出现局部和全身强不良反应，抗体阳转率均为100%。说明我国生产的Vero细胞疫苗的质量与法国生产的Vero细胞疫苗相近。

新型狂犬病疫苗的应用

随着分子生物学技术的发展和应用，人们可望以保留狂犬病毒完整的免疫原性而不含狂犬病毒致病性的疫苗，这就是正在发展的疫苗。目前正在研究的新型狂犬病疫苗种类很多，涉及面很广，研究得较早较多的是基因重组疫苗，主要是以活病毒为载体的重组疫苗，最近发展了非复制病毒或复制缺陷病毒为载体的重组疫苗［1，8］。与此同时又发展了DNA疫苗、亚单位疫苗和多肽疫苗等［1］。

1.重组疫苗（recombinant vaccine）

是指应用DNA重组技术，借助载体对狂犬病毒中的基因进行重组和表达，将表达产物或重组体本身用于研制疫苗。其表达方式有以下几种载体：（1）以大肠杆菌为载体。细菌结构简单，培养方便，易于大规模用发酵罐生产，且成本低，因此狂犬病毒重组疫苗的研究最早是以大肠杆菌为表达，但表达量均不太高，不能产生对狂犬病的保护作用，故被放弃研究。最近卫生部武汉生物制品研究所以狂犬病毒

aG株G基因在PET大肠杆菌系统中表达，经固定化金属螯合层析（IMAC）获得纯化的狂犬病毒糖蛋白，实验证明无免疫原性［18］。（2）以活病毒为载体的有：①痘苗病毒（Vaccina virus），自1973年基因工程问世以来，作为基因工程的载体受到人们的青睐，其优点是免疫原性强，可产生体液和细胞免疫应答；对热稳定、易于保存和运输；易于培养，便于生产，成本低；病毒的复制在细胞内进行，不与宿主染色体整合，无致癌性；操作简单，可研制联合疫苗［1］。②腺病毒（Adeno virus）：以人腺病毒作为载体有其独特之处，因为它具有对热、pH稳定和经口感染等特点，特别适用于作为重组疫苗的载体［8］。③杆状病毒（Baculo virus），是一种感染昆虫的病毒，主要包括核型多角体病毒。我国卫生部武汉生物制品研究所和中科院上海生化所联合研究，首先应用杆状病毒为载体，对狂犬病毒基因的研究，试验结果虽然具有良好的免疫效果［1］，但由于昆虫细胞的培养条件高，费用昂贵，受到一定限制。④其他表达系统：即狂犬病毒在其他系统的表达有酵母和哺乳动物细胞等。

2.DNA疫苗

狂犬病病毒DNA疫苗的研究于1994年由Wistar研究所的Xiang首先报道，将编码狂犬病毒糖蛋白的cDNA插入到质粒DNA中，将构建的质粒直接注射小鼠腓肠肌，免疫3次，间隔2～3周，每次150 μg。免疫后小鼠产生了狂犬病毒中和抗体，至第5周达高峰，并维持一段时间。免疫后9～11个月的小鼠用狂犬病毒攻击仍具有保

护作用，而且未发现明显副反应。我国于1997年中国人民解放军兽医大学扈荣良等首次将G基因插入PMTOIO/A+表达质粒中，以该质粒DNA用肌肉途径免疫小鼠，能诱导产生狂犬病毒抗体，初步证明有免疫效果。接着卫生部武汉生物制品研究所李萍等［19］将狂犬病毒G 基因重组到质粒PRC/CMV中，然后对小鼠免疫可产生抗狂犬病毒中和抗体，对狂犬病毒的攻击也有一定保护作用。现在我国已有更多实验室进行狂犬病毒的DNA疫苗研究。DNA疫苗便于制备，成本低，DNA 对热稳定，保存方便，接种量少，仅一次免疫可引发长期的体液和细胞免疫应答反应。但安全问题有待进一步观察。

3.亚单位疫苗（subunit vaccine）

为获得更安全的抗狂犬病毒疫苗，改进现有的常规疫苗，开发一种只含有所需免疫原性的亚单位疫苗是非常必要的。根据亚单位的来源和研制方法，可分为狂犬病毒糖蛋白亚单位疫苗和基因工程亚单位疫苗。①狂犬病毒糖蛋白亚单位疫苗：狂犬病毒主要起免疫作用的是糖蛋白，为此亚单位疫苗首先是用糖蛋白来制备。②基因工程亚单位疫苗：用基因工程的方法来提取狂犬病毒起免疫作用的蛋白制备亚单位疫苗。近年来已证明核糖核酸蛋白也具有保护性。卫生部武汉生物制品研究所苏焱等［21］用3批从狂犬病毒提取的纯化核糖核酸蛋白和3批从重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的纯化核蛋白分别比较，结果证明两者的抗原性和免疫性无差异。

4.多肽疫苗(polypeptide vaccine)［22］

1982年Dietzschold等［23］把提纯狂犬病毒ERA株的糖蛋白，采用溴化氰（CNBr）化学裂解法，裂解成7个大小不等，从32～77个氨基酸残基的多肽片段，在还原性SDS PAGE中分成7条肽带，发现其中Cr1、Cr3和Cr4等3个片段可诱生中和抗体，其滴度为180、270和510，因而认为这些片段可能存在诱生狂犬病毒中和抗体的抗原决定簇，在体外可激活T淋巴细胞，这一现象是一个研究多肽疫苗的良好开端。

综上所述狂犬病疫苗发展经历羊脑疫苗到各种细胞培养疫苗的过程。近年来又研究成功Vero细胞疫苗，从而解决了人用脑组织疫苗接种后引发的神经系统合并症、针次多和效价低的问题。分子生物学的研究为狂犬病疫苗的研制打下了基础。目前在新型疫苗研究中，最令人鼓舞的是以病毒为载体的新型重组减毒活疫苗和DNA疫苗都很有发展前景。发展中的亚单位疫苗和多肽疫苗，对提高免疫原性，也带来了新的希望。但这些新型疫苗与传统的细胞培养疫苗相比，用于预防人类狂犬病，特别是暴露后的预防，其安全性和有效性尚有待研究。研究认为，新型疫苗应重点解决动物狂犬病，才可能达到降低人类狂犬病的发病率。总之，要研究出免疫原性高，安全、有效、廉价且易于生产的狂犬病疫苗，人们还要进行深入研究与探讨。

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