红色荧光蛋白的原核表达
红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达
生物学实验教学中心 报告题目
红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达 作者姓名
饶慧 班级学号
0802班/2008114010214 指导教师
王友如 完成时间 2011年02月
目录
引言 (1)
1实验材料及实验仪器 (4)
1.1实验材料 (4)
1.2实验仪器 (5)
2实验方法 (7)
2.1 重组质粒的构建 (7)
2.2工程菌株的活化 (7)
2.3诱导表达 (8)
2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8)
3 结果与分析 (9)
总结 (10)
参考文献 (11)
致谢 (13)
红色荧光蛋白的原核表达
饶慧
（指导老师：王友如）
（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）
摘要实验目的：研究红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。实验方法：通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。
关键词红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达
分子生物学综合实验
Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP)
Rao Hui
(Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi,
Hubei,435002 )
Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ). Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression
红色荧光蛋白的原核表达
饶慧
（指导老师：王友如）
（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）
引言
基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白在某种定义下可以说是革新了生物学研究——运用荧光蛋白可以观测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等等。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。
1999年，Matz 等[2]从印度洋—太平洋地区的珊瑚虫中分离出6 种与绿色荧光蛋白(green fluorescentproteins ,GFP) 同源的荧光蛋白,并鉴定了它们的光谱性质。红色荧光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因,其蛋白质的最大吸收光谱为583nm，不需要任何预处理便可检测到[3]。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因，但作为原核细胞表达的报告基因还鲜有报道[4]。
自1999年红色荧光被发现后,引起了科学家广泛的兴趣,人们对其理化性质和发光机制进行了深入的研究；通过对其修饰,人们得到了聚集程度低、成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的突变株[5]。许多红色荧光蛋白已经具备了优良的性质，并广泛应用于生命科学研究.。但即使是性能优良的红色荧光蛋白，仍然有较大的定向改造余地。例如，发展高亮度、远红外发射的单体荧光蛋白，将在深部组织成像方面有重要意义[6]。
PCR技术是Kary Mullis在1985年建立起来的在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5'端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的
特意的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域[7]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[8]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[9]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[10]。
随着人们对原核和真核生物基因调控的了解，通过综合控制基因转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因1 0的启动子及Lac启动子等。Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。根据原核生物基因表达特点选着载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质[11]。
蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳（electrophoresis）。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺在引发剂（过硫酸铵）和增速剂（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T％成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可
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被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT）或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样本中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合,可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15 KD到200 KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹（Western Blot）的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等[12]。
研究红色荧光蛋白在大肠杆菌体内的原核表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，并用IPTG诱导其在大肠杆菌体内进行表达，最后用SDS-PAGE检测是否诱导表达成功。根据电泳结果得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
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1实验材料及实验仪器
1.1实验材料
E.coli DH-5ɑ(pDsRed-N1)和E.coli DH-5ɑ(pET-28ɑ)菌株（由本实验室保存）；
溴酚蓝；
TEMED；
IPTG(1 mM)；
标准蛋白；
SDS 10%(W/V)；
LB液体培养基；
卡那霉素100 mg/mL；
过硫酸铵10 mL10%(W/V) (现配现用）；
Tris·HCl（pH 6.8）8×：在40 mL水中溶解6.05 g Tris碱（0.5 mol/L），用1 mol/L HCl 调校至pH 6.8，补加水至整体积100 mL，用0.45 um滤膜过滤，再加入0.4 g SDS [0.4%(m/V)] 溶解后于4°C保存；
30%凝胶贮备液
丙烯酰胺29%（W/V）
N,N'-亚甲基-双丙烯酰胺1% （W/V）
15 %的分离胶
双蒸水 4.7 mL
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 5.0 mL
10 % SDS 200 uL
30 %丙烯酰胺溶液10 mL
TEMED 10 uL
10 % 过硫酸铵100 uL
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总体积20 mL
混匀后加入电泳槽的玻璃板夹缝中，并在胶面上加入约2 mL双蒸水，1 h 后等胶自然凝聚，去净双蒸水，并在夹缝中放入梳子；
5%的浓缩胶
双蒸水 5.8 mL
0.5 mol/L Tris·HCl （pH6.8） 2.5 mL
10 % SDS 100 uL
30 % 丙烯酰胺溶液 1.6 mL
TEMED 10 uL
10 % 过硫酸铵50 uL
总体积10 mL
混匀后加入夹缝中并没过梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔，清除未凝聚的丙烯酰胺；
Tricine样品缓冲液（2×）
Tris·HCl/SDS pH 6.8（0.08 mol/L） 2 mL
甘油[24 %（V/V）](3.0 g) 2.4 mL
SDS [8 % (m/V)] 0.8 g
DTT（0.2 mol/L）0.31 g
考马斯亮蓝G-250 [0.02 % (m/V)] 2 mg
总体积10 mL
固定液：甲醇：水：乙酸（30:10:60）（V/V/V）；
脱色液：甲醇：水：冰醋酸（4.5:4.5:1）（V/V/V）；
染色液：0.25 g考马斯亮蓝(R250)溶解于100 mL脱色液。
1.2实验仪器
1.BCM-1000生物洁净工作台苏州净化设备有限公司
2.THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器太仓市实验设备厂
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3.DYY-12型电泳仪北京市六一仪器厂
4.TGL-16C台式离心机上海安亭科学仪器厂
5.HJ-3控温磁力搅拌器江苏金坛市金南仪器厂
6.雷磁PHS-3C pH计上海精密科学仪器有限公司
7.AB204-N 电子天平Mettler-Toleda Group
8.KDM型调温电热套武汉精华科教仪器有限公司
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2实验方法
2.1 重组质粒的构建
图1重组质粒pET-28a-RFP的构建流程
Fig. The formed technological process of pET-28ɑ-RFP recombined plasmid
2.2工程菌株的活化
2.2.1 将卡那霉素100 mg/mL以1:1000 的比例加入LB液体培养基中，再将LB液体
培养基取2 mL分装至无菌红帽试管中。
2.2.2 取活化的工程菌株10 uL于红帽试管中。
2.2.3 37 °C条件下180 rpm过夜培养。
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(注意问题：所有操作均在无菌条件下进行,注意超净工作台的操作步骤及注意问题。)
2.3诱导表达
2.3.1 将过夜培养物按照1:100的比例加入至含卡那霉素的培养基中，37 °C条件下180 rpm培养2-4 h至对数期。
2.3.2 将IPTG(1 mM)按照1:1000的比例加入至培养基中，每隔2 h观察培养基的颜色变化。设置一个对照（不加入IPTG）。
(注意问题: 所有操作均在无菌条件下进行。)
2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白
2.4.1配制15 % 的分离胶
2.4.2配制5 % 的浓缩胶
2.4.3样品制备
取菌液10000 r/min 离心2 min，弃上清，沉淀与2×上样缓冲液1:1混匀，在沸水中水浴3-5 min，取出，10000 r/min 离心2 min，上清液即为样品。
2.4.4上样与电泳
将样品及标准蛋白加入点样孔后，接通电源，恒压电泳至溴酚蓝到离底部约3 cm时，停止电泳。
2.4.5染色与脱色
将分离胶从玻璃板上取下，在染色液中染色1-2 h后，在脱色液中过夜脱色，换保存液保存。
2.4.6拍照保存
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3 结果与分析
图2 蛋白质的电泳结果
Lane 1：Marker protein；Lane 2：含质粒pET-28ɑ-RFP的菌液总蛋白质样品（阳性对照）；Lane 3：含空载质粒pET-28ɑ-RFP的菌液总蛋白质样品（阴性对照）。
Fig. 2 the results of the protein electrophoresis
Lane 1: Marker protein; Lane 2:The total protein samples in bacterium fluid containing pET-28ɑ-RFP plasmid (positive contrast); Lane 3: total protein samples in bacterium fluid containing un-loaded pET-28ɑ-RFP plasmid (negative contrast).
（1）用IPTG诱导表达后试管内菌液呈现红色，说明含外源基因RFP的质粒在大肠杆菌体内成功表达。
（2）由图2可以看出，阳性对照比阴性对照多了一条带，即为表达的目的基因（约44 KDa）。说明了阳性对照中质粒重组成功，并成功转入大肠杆菌体内和在其体内成功诱导表达；阴性对照重组质粒未成功转入大肠杆菌体内不含目的基因，故加入IPTG后未能显现红色，且电泳后比阳性对照少了一条带。
9
总结
本实验是一个综合性实验，与我们平时的实验相比对我们的要求更多更严。它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。跟我们平时的实验相比较我们的实验素养可以得到很大的提高，有利于我们今后的学习和研究。通过本次实验我深刻的认识到了，在我们做研究的过程中一定要认真，每一步都不能出错，否则将功亏一篑，从头开始。
在实验的过程中，制胶的过程出现了一些问题，使得凝胶不能聚合，分析原因可能有：(1)试剂质量差，应使用电泳级别的试剂(2)过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液(3)凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。
在实验的过程中我们还应该注意的有：
1．上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。
2．经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。
3．注意避免电泳条带弯曲畸变：(1)“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善(2)“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀(3)“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服(4)“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。
4．非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。
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参考文献
1贾艳华，李国勋，张杰荧光蛋白及其应用
2 Matz MV , Fradkov AF , Labas YA , et al . Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species [J ] . Nat Biotechnol , 1999 , 17(10) :969 - 973.
3龙华，尾里，建二郎，若松佑子，松岛良次红色荧光蛋白（RFP）基因在转基因青鳉中的表达，中国青年农业科学学术报2002
4邢万金，赵宇航，任仕超，包晓红红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用内蒙古大学学报(自然科学版) , Journal of Inner Mongolia University，2008年05期
5郝丽梅，李唐棣，梅兴国红色荧光蛋白的研究进展，国外医学药学分册，2006年4月，第33卷第2期
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7魏春红，李毅主编聚合酶链反应----PCR现代分子生物学技术高等教育出版社，2006.7:45-46
8 Nuc P. Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem,2006,52 (4):448-456.
9 Dong X,Tang B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli [J].J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299-307.
10吕素芳，刘峥，郭广君，蔡永萍，邱德文大肠杆菌中表达外源重组蛋白的研究
11 魏春红，李毅主编原核细胞中外源基因的表达和初步纯化，现代分子生物学技术，高等教育出版社，2006.7:95-97
12魏春红，李毅主编蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，现代分子生物学技术，高等教育出版社，2006.7 :101-102
13何志强，薛渊，石燕，杨恒，赵银霞，王楷文，周成林，王胜军，邵启祥，焦志军，许化溪，远红荧光蛋白HcRed基因的原核和真核表达及鉴定
11
14曹永宽，莫永炎，薛刚，王培红，姜勇，田伏洲RFP-AWP1原核表达载体的构建及表达特性研究，《华西医学》2008年第23卷第4期
15 Rafalska Metcalf IU, Janicki SM. Show and tell: visualizing gene expression in living cells[J]. J Cell Sci, 2007, 120(14): 2301-2307.
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致谢
衷心感谢王友如老师对本论文的精心指导。老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。在此，谨向老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！
当然，本论文的顺利完成，也离不开同学们的关心和帮助。在此真诚感谢他们的耐心指导和大力帮助，使得我们共同前进。在校学习期间，得到同班所有同学的关心和帮助，在此向他们一并表示深深的感谢，愿同窗之间的友谊永远长存。同时，还要感谢大学期间来所有的老师，让我在学好专业知识的同时更全面的发展；感谢生命科学院给了我这片天地以及对我的大力栽培。最后，我要把一份特别的感谢献给我的家人和朋友，感谢他们一直以来对我的关爱与宽容、理解与支持。
珍惜、知足、感恩。
饶慧
2011.04.23
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原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略
第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋,梁宋平,李 敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达 中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成 外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.
红色荧光蛋白的原核表达
红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达 生物学实验教学中心 报告题目 红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达 作者姓名 饶慧 班级学号 0802班/2008114010214 指导教师 王友如 完成时间 2011年02月
目录 引言 (1) 1实验材料及实验仪器 (4) 1.1实验材料 (4) 1.2实验仪器 (5) 2实验方法 (7) 2.1 重组质粒的构建 (7) 2.2工程菌株的活化 (7) 2.3诱导表达 (8) 2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8) 3 结果与分析 (9) 总结 (10) 参考文献 (11) 致谢 (13)
红色荧光蛋白的原核表达 饶慧 （指导老师：王友如） （湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002） 摘要实验目的：研究红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。实验方法：通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。 关键词红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达
分子生物学综合实验 Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ). Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression
荧光蛋白(整理)
荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP ）
在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb 。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基（Ser65-Tyr66-Gly67 ）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching ），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （3）野生型 野生型GFP（wild type GFP, wtGFP ）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP （EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 （5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP） 为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 （6）增强型黄色荧光蛋白（EYFP）另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变。在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
浅谈原核表达
浅谈原核表达的技巧 摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。 关键词：原核表达表达载体限制性内切酶 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。 一、原核表达一般程序 表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。 二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。 （1）对表达载体的分析 载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。 在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。 （2）对目的片段的分析 基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论，
毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策
万方数据
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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策 作者：丁镌， 宋跃芬， 袁野， 刘娣 作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)， 袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)， 刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨 ,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086) 刊名： 畜牧与兽医 英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2007,39(2) 被引用次数：1次 参考文献(9条) 1.Li A;Xiong F;Lin Q Low temperature increases the yiede of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(3) 2.Potter K L;Zhang W;Smith L A Production and purification of the heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin,serotype A,expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(3) 3.Inan M;Meagher M M The effect of ethanol and acetate on protein expression[外文期刊] 2001 4.Brierley R A Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-1) 1998 5.Dring F;Klapper M;Theis S Use of the glyceroldehyde 3phosphate dehydrogenase promoter for production of functional mammalian membrane transport proteins in the yeast Pichia Pastoris[外文期刊] 1998(2) 6.Goodrick J C;Xu M;Finnegan R High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia Pastoris expression system[外文期刊] 2001(06) 7.Scorer C A;Buckholz R G;ClareJ J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastori[外文期刊] 1993 8.Monteino R;Garcia R;Quintero O Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 1998(02) 9.隋少飞;陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通讯 2004(03) 引证文献(1条) 1.王希辉.岳寿松.胡敬东.黄亦钧.陈金龙.王婷婷.范忠玲.赵宏坤鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[期刊论文]-微生物学报 2010(9) 本文链接：https://www.360docs.net/doc/1a2122606.html,/Periodical_xmysy200702022.aspx
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码 的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带 的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
原核表达步骤
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略 1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理 在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。 根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。 表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶 Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathway Enzyme Type Gene Zymogen form Vacuole PrA Aspartic PEP4 Yes PrB Serine PRB1 Yes CpY Serine PRC1 Yes CpS Metallo-( Zn2+) CPS1 Unknown ApI Metallo-( Zn2+) LAP4 Yes ApCo Metallo-(Co2+) DAP2 No DPAP-B Serine SEC11 Unknown Secretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 No DPAP-A Serine STE13 Unknown,predict no Yeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes 酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。 在P.pastoris生长和表达外源蛋白过程中，由于碳源从葡萄糖或甘油到甲醇的改变，甲醇代谢酶系（AOX,FAD,DHAS等）和过氧化氢体逐步积累，同时，相应的蛋白酶也产生了。由于细胞器胁迫的影响，过氧化氢体一部分在基质中自噬降解，大部分过氧化氢体转运到液泡中得到降解。 P.pastoris中位于与细胞膜结合的胞内蛋白酶类可分为蛋白质水解酶（内切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶类组成。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前体经过酶切活化而成，按照其作用活性位点又分为4类，丝氨酸类蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶和天冬氨酸类蛋白酶。丝氨酸类蛋白酶最适pH值比较高，又叫碱性蛋白酶，而天冬氨酸类蛋白酶需要低的pH范围，又叫酸性蛋白酶。主要的液泡内蛋白酶有以下几种：蛋白酶A
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤 PartⅠ选择表达的目的基因 一、基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA 的ORF中找到正确的读码。 ②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 ③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： ①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、抗原决定簇的预测 1、原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、选择原则： （1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。