单克隆B细胞抗体制备技术

摘要：

单克隆B细胞抗体制备技术是一种重要的生物技术手段，可以用于制备高纯度、高特异性的单个抗体。本文将介绍单克隆B细胞抗体制备技术的原理、流程和应用，并分享个人对该技术的观点和理解。

1. 引言

单克隆抗体是一类来源于同一B细胞克隆群体的抗体，具有高度特异性和单一亚型。在疾病诊断、治疗和基础研究等领域起着重要作用。而单克隆B细胞抗体制备技术是制备单克隆抗体的关键步骤。

2. 原理

单克隆B细胞抗体制备技术基于对B细胞的单个克隆，利用B细胞的特异性抗体编码基因序列，通过融合细胞和重组DNA技术，将B细胞的克隆扩增并以单个细胞的形式保持。这样就可以获得高特异性和高亲和力的单克隆抗体。

3. 流程

制备单克隆抗体的流程可分为以下几个步骤：

(1) 免疫原接种：将目标免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。

(2) B细胞分离：从免疫动物中分离出淋巴细胞，经过离心、洗涤等步骤得到B细胞。

(3) 克隆纯化：利用细胞分选技术，将单个B细胞分选出来。可以使用流式细胞术、限制稀释法或磁珠分选等方法。

(4) 细胞融合：将被分选出的单个B细胞与合适的被选择的肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

(5) 杂交瘤筛选：利用选择性培养基，筛选出具有高产抗体能力的杂交瘤细胞。

(6) 单克隆抗体鉴定：对筛选出来的杂交瘤细胞进行鉴定，包括抗原特异性测定、亚型鉴定和亲和力测定等。

(7) 大规模培养：将鉴定合格的单克隆抗体的杂交瘤细胞进行大规模培养，并收集纯化的单克隆抗体。

4. 应用

单克隆B细胞抗体制备技术在医学、生命科学和生物工程等领域具有

广泛的应用价值。例如：

(1) 临床诊断：用于特定疾病的诊断和监测，如肿瘤标志物检测和病毒感染的诊断等。

(2) 治疗应用：开发用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和传染病等的单克隆抗体药物。

(3) 生命科学研究：用于研究细胞信号转导、蛋白质结构与功能等方面。

(4) 生物工程：应用于分子诊断、工业产物检测和环境监测等。

5. 个人观点和理解

单克隆B细胞抗体制备技术是一种非常强大的生物技术手段，可以制

备高纯度、高特异性的单克隆抗体。通过对B细胞的单个克隆和细胞

工程的手段，可以获得极具研究和应用潜力的单克隆抗体。这将推动

医学和生命科学的发展，为疾病的治疗和诊断提供重要的支持。

然而，单克隆B细胞抗体制备技术在实施过程中也存在一些挑战和限制。B细胞克隆的成功率和产量限制了该技术的应用范围。制备过程

中的杂交瘤细胞选择性也是一个关键步骤，需要耗费大量时间和试验。对于一些特定的免疫原，可能会面临困难。在实际应用中需要权衡利

弊，并结合具体情况进行选择。

总结：

单克隆B细胞抗体制备技术是一项重要的生物技术手段，通过对B细

胞的单个克隆，可以制备高纯度、高特异性的单克隆抗体。该技术在

医学、生命科学和生物工程等领域有广泛应用，为疾病诊断、治疗和

基础研究等方面提供了重要的支持。然而，该技术仍面临一些挑战和

限制，在实际应用中需要综合考虑，并寻求改进。未来，随着技术的

发展和研究的进一步深入，单克隆B细胞抗体制备技术将有望发挥更

大的作用。1. 克隆和细胞工程的手段为单克隆抗体制备技术带来了巨

大的研究和应用潜力。这一技术的出现推动了医学和生命科学的发展，为疾病的治疗和诊断提供了重要的支持。

2. 然而，单克隆B细胞抗体制备技术在实施过程中也面临着一些挑战

和限制。B细胞克隆的成功率和产量限制了该技术的应用范围。虽然

现在可以通过多种方法提高克隆的成功率和产量，例如使用免疫磁珠

等技术，但仍然存在着一定的限制。

3. 杂交瘤细胞选择性也是制备过程中的一个关键步骤。为了获得特定

的单克隆抗体，需要选择那些能够产生所需抗体的杂交瘤细胞。然而，这一步骤需要耗费大量的时间和试验，特别是在面对特定的免疫原时

可能会面临困难。

4. 对于某些特定的免疫原，单克隆B细胞抗体制备技术可能会面临一

定的困难。有些免疫原可能具有较低的免疫原性，导致很难从B细胞

中获得高亲和力的抗体。在这种情况下，可能需要使用一些增强抗原

性的方法，如免疫佐剂，来增加抗原的免疫反应。

5. 在实际应用中，需要综合考虑利弊并根据具体情况进行选择。尽管

单克隆B细胞抗体制备技术存在一些挑战和限制，但其仍然是一项重

要的生物技术手段。该技术能够制备高纯度、高特异性的单克隆抗体，在医学、生命科学和生物工程领域有广泛的应用。

6. 未来，随着技术的不断发展和研究的进一步深入，单克隆B细胞抗

体制备技术将有望发挥更大的作用。研究人员可以继续探索提高B细

胞克隆成功率和产量的方法，寻找更高效的杂交瘤细胞选择性方法，

并开发更强效的免疫佐剂，以应对特定免疫原的挑战。

7. 可以通过结合其他技术手段，如基因编辑技术CRISPR-Cas9，进一步优化单克隆B细胞抗体制备技术。CRISPR-Cas9技术可以精确编辑细胞中的基因，例如增强抗体的亲和力或改变抗体的特异性。这将进

一步提高单克隆抗体的质量和效果，推动其在医学和生命科学领域的

应用。

单克隆B细胞抗体制备技术是一项重要的生物技术手段，具有极大的

研究和应用潜力。尽管在实施过程中存在一些挑战和限制，但通过综

合考虑利弊，并不断改进和创新，该技术有望为疾病的治疗和诊断提供更好的支持，推动医学和生命科学的发展。

单克隆抗体的制备

单克隆抗体制备动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体的制备过程： 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。注意事项：

➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

单克隆抗体的制备过程

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。制备过程 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融

合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备

小鼠单克隆抗体的制备

小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。 1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。 2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。 3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。 5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。

制备单克隆抗体的原理

制备单克隆抗体的原理单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。制备单克隆抗体的过程可以分为四个步骤：免疫、细胞融合、筛选和扩增。第一步是免疫。在这一步中，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，以刺激其免疫系统产生抗体。这些抗体会被B细胞产生并分泌到血液中。第二步是细胞融合。在这一步中，从免疫小鼠的脾脏中收集B细胞，并与一种特殊的癌细胞（称为骨髓瘤细胞）融合。这种融合产生的细胞称为杂交瘤细胞，它们具有两种细胞的特性：B细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。第三步是筛选。在这一步中，杂交瘤细胞被分配到96孔板中，每个孔中只有一个细胞。然后，每个孔中的细胞被检测其是否产生特定的抗体。这种检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色法。只有产生特定抗体的细胞才会被保留下来。第四步是扩增。在这一步中，产生特定抗体的杂交瘤细胞被扩增，

以获得足够的单克隆抗体。这些抗体可以通过培养杂交瘤细胞或通过收集细胞培养液来获得。制备单克隆抗体的原理是利用B细胞的特异性和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，通过细胞融合和筛选，获得同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。单克隆抗体的应用非常广泛。它们可以用于诊断、治疗和研究。例如，单克隆抗体可以用于检测病原体、肿瘤标志物和药物残留物。它们还可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。此外，单克隆抗体还可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发新的生物技术产品。制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。

单克隆抗体制备过程

单克隆抗体制备过程单克隆抗体是指在免疫反应中仅由一种克隆的B细胞分泌的抗体，其特异性是由单个B细胞的表面受体所决定的。单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力，因此在生命科学和医学领域中得到了广泛的应用。本文将介绍单克隆抗体制备的过程。 1. 免疫原制备制备免疫原是单克隆抗体制备的第一步。免疫原应该是具有高度特异性的抗原，能够刺激机体产生高亲和力的抗体。常用的免疫原有蛋白质、多肽、糖类、核酸等。在制备免疫原的过程中，需要注意免疫原的纯度和活性。 2. 免疫动物免疫在制备单克隆抗体的过程中，需要使用免疫动物进行免疫。常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。在免疫过程中，需要注意免疫动物的健康状况和免疫方案的制定。免疫方案应该包括适当的免疫原剂量、免疫时间和免疫途径等。 3. 脾细胞提取在免疫过程中，免疫动物的脾脏是提取免疫细胞的主要来源。提取脾细胞的方法包括机械破碎、胶原酶消化等。在脾细胞提取的过程

中，需要注意细胞的纯度和活性。 4. 杂交瘤细胞制备单克隆抗体的制备需要使用杂交瘤技术。杂交瘤细胞是由脾细胞和肿瘤细胞融合而成的细胞系，具有不限增殖能力和稳定性。在杂交瘤细胞制备的过程中，需要注意肿瘤细胞的选择和融合条件的优化。 5. 筛选单克隆抗体在杂交瘤细胞制备完成后，需要对杂交瘤细胞进行筛选，以筛选出具有特异性的单克隆抗体。常用的筛选方法包括ELISA、免疫印迹、流式细胞术等。在筛选过程中，需要注意抗体的特异性和亲和力。 6. 生产单克隆抗体在筛选出具有特异性的单克隆抗体后，需要进行大规模的制备。制备单克隆抗体的方法包括体外培养和体内制备。在制备过程中，需要注意抗体的纯度、活性和稳定性。单克隆抗体制备过程是一个复杂的过程，需要对各个环节进行精细的操作和严格的控制。通过合理的制备过程，可以得到高品质的单克隆抗体，为生命科学和医学领域的研究和应用提供了重要的工具。

抗体的制备

单抗：过程：单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。制备过程： 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 (1)抗原制备。(2) 免疫动物的选择。 (3)免疫程序的确定。（免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因

为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。） 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

单克隆抗体的原理、发展历程及制备流程综述

单克隆抗体的原理、发展历程及制备流程综述通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,加上单细胞克隆在临床和诊断上的巨大作用,单克隆抗体技术已经是现在生物领域研究的重要组成部分。此文就单抗隆技术的原理、发展和研究方向等进行了综述,并对其存在的不足作了概述。 1.单克隆抗体原理抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。 2.单克隆抗体的发展

1975年，英国的科学家Kohler和Milstein合作将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现形成的杂交细胞既能在体外无限增殖，又能持续的分泌特异性的抗体，通过克隆化的培养可获得纯的细胞可以产生单克隆抗体。因此在1984年获得了诺贝尔医学和生理学奖。在单克隆技术出现之后，许多研究者发现了这一技术的前景，纷纷投入到这一领域的研究。该技术也飞速的发展起来，到二十世纪八十年代中期，单克隆技术已日臻完善，开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。特别是在2000年后，人类基因组草图绘制的完成，生命科学的发展将进入后基因组时代。可以肯定的是，在未来的一段时间，人们对各种单克隆抗体的的需求会有一个很大的增长，继而，单克隆技术会有一个很大的发展。 2.1.单克隆抗体的应用 2.1.1.作为亲合层析的配体单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。 2.1.2作为生物治疗的导向武器质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。 2.1. 3. 作为免疫抑制剂抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。 2.1.4作为研究工作中的探针

单克隆抗体的制备技术

单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。 1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。免疫原的选择基于所需抗体的特异性。一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。 2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。 3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。

4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。 5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。 6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。这些测试可以验证抗体的特异性和效能。总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。通过对这些杂交瘤细胞的筛选和分离，可以建立纯化的单个细胞克隆，这些克隆细胞会持续产生与特定免疫原结合的特异性抗体。这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等多个领域。

单克隆抗体技术路线

单克隆抗体技术路线引言：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。一、单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。二、单克隆抗体制备步骤 1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。 2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。 3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。 4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。 5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。

6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。三、单克隆抗体技术的应用领域 1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。 2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。 3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。 4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。结论：单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法和生物制药工具，其制备步骤简单明了，应用领域广泛。随着技术的不断发展和完善，单克隆抗体技术在生物医学领域将发挥越来越重要的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的选择和可能。相信随着对单克隆抗体技术的深入研究和应用，必将为人类健康事业作出更大贡献。

单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤 1.抗原选择：首先，选择需要制备单克隆抗体的目标抗原。这个抗原可以是来自于生物体的蛋白质、多肽、糖或其他小分子。 2.免疫动物选择：根据抗原的种类选择适当的动物进行免疫。一般常用的动物包括小鼠、大鼠和兔子。 3.免疫接种：将选定的抗原注射到免疫动物体内，激发其产生抗体。在接种前，可以根据需要选择适当的免疫佐剂来增强免疫效果。 4.血清采集：在免疫动物产生了充分的免疫应答后，采集免疫动物的血清。 5.B细胞获取：从免疫动物的脾脏或骨髓中获取B细胞，这些细胞可以产生特定的抗体。 6.融合细胞生成：将B细胞与骨髓瘤细胞（如鼠骨髓瘤细胞NS1或人骨髓瘤细胞SP2/0）用聚乙二醇等化学物质或电穿孔法进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。 7.杂交瘤筛选：通过增殖选择方法（如HAT培养基）对细胞进行筛选，筛选出具有产生抗体能力的杂交瘤细胞。 8.单克隆细胞扩增：选出抗体阳性的培养皿（通常是96孔板）中的单克隆细胞，继续进行扩增培养。 9.抗体检测：通过ELISA、免疫组化等方法检测细胞上所产生的抗体的特异性和亲和力。

10.抗体纯化：对单克隆抗体进行纯化，可借助离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术。这些技术可以去除与抗体无关的其他蛋白质或污染物。 11. 抗体鉴定：对纯化的抗体进行进一步的检测和鉴定，包括亲和力测定、特异性检验、Western blot等。 12.抗体应用：经过鉴定合格的单克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀等多种分子生物学和生物医学研究领域。需要注意的是，单克隆抗体的研制是一项技术较为复杂和专业化的工作，需要科研人员具备一定的实验技术和经验。同时，不同抗原和动物的特点也需要在实验设计时进行充分的考虑。

单个b细胞抗体制备技术

单个B细胞抗体制备技术 1. 引言单个B细胞抗体制备技术是一种用于研究和生产单个B细胞中特定抗体的方法。这种技术的发展为我们深入了解免疫系统的功能以及开发更有效的免疫治疗方法提供了重要工具。本文将介绍单个B细胞抗体制备技术的原理、步骤以及应用。同时，还将讨论该技术在药物开发、疾病诊断和治疗等领域中的潜在应用。 2. 原理单个B细胞抗体制备技术基于单细胞测序和重组DNA技术，通过以下步骤实现： 2.1 单细胞分离首先，从免疫系统中获得目标B细胞，可以通过活体或死体组织获得。然后，使用流式细胞仪或显微操作来将单个B细胞分离出来，并将其置于96孔板或其他适当的容器中。 2.2 RNA提取和转录本测序接下来，对每个单个B细胞进行RNA提取，并使用逆转录酶合成cDNA。随后，进行转录本测序，获取每个单个B细胞的抗体基因序列信息。 2.3 抗体基因克隆和表达根据测序结果，选择目标抗体基因进行克隆和表达。通过引物设计和PCR扩增，将抗体基因插入适当的载体中，并转染到表达宿主细胞中。最终得到重组抗体。 3. 步骤单个B细胞抗体制备技术的步骤如下： 1.准备样品：从免疫系统中获得目标B细胞样品。

2.单细胞分离：使用流式细胞仪或显微操作将单个B细胞分离出来。 3.RNA提取：对每个单个B细胞进行RNA提取。 4.逆转录和cDNA合成：使用逆转录酶合成cDNA。 5.转录本测序：对每个单个B细胞的cDNA进行测序。 6.数据分析：对测序数据进行分析，获取抗体基因序列信息。 7.引物设计和PCR扩增：根据测序结果设计引物，并通过PCR扩增目标抗体基因。 8.克隆和表达：将目标抗体基因插入适当的载体中，并转染到表达宿主细胞中。 9.重组抗体纯化：从表达宿主细胞中提取、纯化重组抗体。 4. 应用单个B细胞抗体制备技术在以下领域有着广泛的应用： 4.1 药物开发单个B细胞抗体制备技术可以帮助研究人员鉴定和筛选具有特定功能的抗体，如特异性结合靶标、中和病原体等。这些抗体可以作为药物开发的候选物，用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病等。 4.2 疾病诊断通过单个B细胞抗体制备技术，可以获得大量不同来源的单个B细胞中的抗体信息。这些信息可以用于开发高灵敏度和高特异性的诊断试剂盒，用于早期癌症检测、感染性疾病诊断等。 4.3 疾病治疗利用单个B细胞抗体制备技术，可以获得特异性的抗体，用于治疗各种疾病。例如，通过克隆和表达特定抗体基因，可以生产大量的重组抗体，并将其用于免疫疗法，如单克隆抗体治疗。 5. 结论单个B细胞抗体制备技术是一种重要的工具，可用于研究和应用于药物开发、疾病诊断和治疗等领域。该技术通过分离、测序和表达单个B细胞中的抗体基因，使我们能够深入了解免疫系统，并开发出更具针对性的治疗方法。

单克隆抗体制备的原理

单克隆抗体制备的原理引言：单克隆抗体是一种与特定抗原高度亲和的抗体，它由单一的B细胞或其衍生的细胞克隆产生。单克隆抗体制备是一项重要的生物技术手段，广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。本文将介绍单克隆抗体制备的原理及其在科学研究和医学应用中的重要性。一、单克隆抗体的起源和背景抗体是机体免疫系统中产生的一种特殊蛋白质，可以识别和结合抗原，从而参与免疫应答。传统的抗体制备方法主要依赖于动物免疫，但存在许多局限性，如免疫反应的不可控性、抗体来源有限等。为了解决这些问题，科学家发展出了单克隆抗体制备技术。二、单克隆抗体制备的原理单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术。具体步骤如下： 1. 抗原免疫：将目标抗原注射到小鼠等哺乳动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。 2. 细胞融合：从免疫小鼠体内提取B细胞和骨髓细胞，将它们与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞株SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。 3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮于含有选择性培养基的培养皿中，

使非杂交细胞死亡，只留下杂交瘤细胞。 4. 单克隆细胞扩增：将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每孔只包含一个细胞，培养并扩增单克隆细胞。 5. 单克隆抗体收集：从培养上清中收集单克隆抗体，经过纯化和鉴定，获得纯度较高的单克隆抗体。三、单克隆抗体制备的重要性 1. 高亲和力和特异性：与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的亲和力和特异性，可以更准确地结合目标抗原。 2. 可重复性和稳定性：单克隆抗体制备的过程可以被重复进行，从而获得相同的抗体产品。此外，单克隆抗体也具有较长的稳定性，可以在不同实验条件下保持一致的性能。 3. 应用广泛：单克隆抗体广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。例如，单克隆抗体可以用于肿瘤标记、疾病诊断、药物靶点鉴定等。 4. 抗体工程的基础：单克隆抗体的制备为后续的抗体工程提供了基础。通过改变单克隆抗体的结构和功能，可以获得更加理想的抗体产物。结论：单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术，

单b细胞抗体技术流程

单b细胞抗体技术流程单B细胞抗体技术流程引言: 单B细胞抗体技术是一种重要的抗体研发方法，它能够通过分离和鉴定单个B细胞，获取其产生的单克隆抗体，为药物研发和治疗提供了新的途径。本文将介绍单B细胞抗体技术的整体流程，包括B 细胞的采集、单细胞分离、抗体基因的测序与分析、抗体的表达和功能验证等环节。一、B细胞采集 B细胞是机体免疫系统中产生抗体的主要细胞类型，其存在于淋巴组织、骨髓等部位。B细胞的采集可以通过外周血、脾脏、淋巴结等方式进行。一般情况下，外周血是最常用的B细胞采集来源，可以通过静脉采血后，离心分离白细胞层来获取B细胞。二、单细胞分离单细胞分离是单B细胞抗体技术的关键步骤之一。传统的方法是通过限稀稀释，将单个B细胞分散在微孔板中，使得每个孔中只有一个B细胞。现代化的方法则是利用流式细胞术或微流控技术实现单细胞的精确分离。这样可以保证每个孔中只有一个B细胞，避免克隆性不纯的情况。三、抗体基因的测序与分析

在获得单个B细胞后，需要提取其中的抗体基因进行测序和分析。这一步骤可以通过PCR扩增抗体基因的可变区域，然后进行测序。测序后的数据可以通过生物信息学方法进行分析，包括基因序列的比对、突变的鉴定和亲和力的评估等。四、抗体的表达通过抗体基因的测序和分析，可以选择出合适的抗体基因进行表达。一般而言，选择较高亲和力和较好表达效果的抗体基因进行进一步的研究。抗体基因可以通过重组蛋白表达系统进行表达，常用的系统包括哺乳动物细胞表达系统和大肠杆菌表达系统等。五、抗体的功能验证抗体基因表达后，需要对其进行功能验证，确定其抗原结合能力和生物活性。常用的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化染色、流式细胞术等。这些方法可以评估抗体的亲和力、特异性、中和活性等功能。六、抗体的应用经过功能验证后的抗体可以用于各种应用领域，包括疾病诊断、药物研发和治疗等。例如，抗体可以用于识别特定的肿瘤标志物，进行早期癌症诊断；抗体也可以作为药物载体，用于传递药物到特定的细胞或组织中，实现精准治疗。结论:

单克隆抗体制备的主要技术

单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术 _______________________________ 单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。 1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。 2、制备抗原

根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。 3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。 4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。它能够快速、有效地产生高度特异性的单克隆抗体，并且有一定的重复性。此外，它还具有低成本、易于扩增和保存的优势。三、单克隆抗体制备的应用

单克隆抗体技术的应用和制备

单克隆抗体技术的应用和制备一、单克隆抗体的应用抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体药物的技术开发经历了鼠源单克隆抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体。这三种治疗性的单克隆抗体都已经在美国上市，鼠源性单克隆抗体由于副反应大，代谢快，已经逐渐退出市场。不过，由于这一特点，目前放射性元素标记的单克隆抗体药物主要使用鼠源性单克隆抗体。近年来开发的单克隆抗体主要是人源化的单克隆抗体，人源化及全人源单克隆抗体由于副反应小，在体内停留时间长，有利于治疗。单克隆抗体的主要应用 1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。 2、用于治疗疾病和运载药物。把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。二、单克性抗体的制备 1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。 2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞才能在选择

单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备一、单克隆抗体技术的原理 B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较,见下表: 性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μg/ml 多 mg/ml 无关的Ig 多少或几乎无其它血清蛋白有少，培养物上清常有 10％胎牛血清 Ag-Ab结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。结合到共同决定簇则是完全的

单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术

使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：二、基本方法

1. 抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。 2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞应选择