单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体制备法

1. 免疫动物：采用合适体表面抗原的方案，给指定动物（通常为小鼠）注射给定的抗原合剂，产生抗原特异性免疫应答，使动物体内产生单克隆抗体。

2. 抗体分离：采用配体结合层析或免疫沉淀法从免疫动物血清或体液中分离出单克隆抗体，用硫酸铵离析可以得到抗体的抗原特异性的的IgG类分子。

3. 抗体纯化：采用实现纯化的技术结合其他细胞分析技术，将抗体从抗体分离产物中得到抗体的纯度大于95%的IgG纯化成分。

4. 抗体测试：可以采用实验室的抗原-抗体免疫试验来确认得到的单克隆抗体的特异性以及抗体复应性，检测其免疫固定特异性以及抗体复应性，确认其抗体复应性。

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。方法动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体制备全攻略(一)[1].

一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody,简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,简称单抗。与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术 (一杂交瘤技术的诞生

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。注意事项：

➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

单克隆抗体的制备方法

单克隆抗体的制备方法单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是指由同一个B细胞克隆株产生，针对同一个特定抗原结构的抗体分子。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有高度的特异性和一致性，因此在医学、生物学和生物工程领域有着广泛的应用。下面将介绍单克隆抗体的制备方法。二、免疫与细胞融合 1.免疫：将特定抗原注射入小鼠体内，激活免疫系统产生抗体。通常需要多次免疫来增强免疫应答。 2.细胞融合：将小鼠脾细胞（B细胞）与骨髓癌细胞进行细胞融合。骨髓癌细胞具有不限制增殖的特性，可以保证融合后的细胞永生长。三、细胞筛选与培养 1.筛选：将细胞混合溶液分装入多孔板，进行细胞浓度稀释，使每个孔中只存在一个细胞。之后进行培养，使细胞形成单个克隆。 2.培养：将筛选出的细胞转移到含有胎牛血清的培养基中，维持细胞生长。根据细胞克隆的特性，可以采用悬浮培养或贴壁培养的方式。四、抗体分离与鉴定 1.抗体分离：将培养基收集，离心沉淀，得到抗体含量较高的上清液。 2. 抗体鉴定：进行免疫学方法的检测，例如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫印迹（Western blot）。通过对不同抗原的反应特异性和亲和力进行检测，确定具有特殊功能的单克隆抗体。

五、扩充与保存 1.规模扩大：将具有特异性、亲和力较高的单克隆抗体细胞进行大规模培养，获得大量的抗体。 2.冻存保存：使用液氮冷冻细胞保存技术，将单克隆抗体细胞冷冻保存，以备后续的使用和生产。六、应用领域单克隆抗体具有广泛的应用领域，包括医学诊断、疾病治疗和生物学研究等。在医学诊断中，单克隆抗体可以用于检测肿瘤标志物、病原体和药物残留物等。在疾病治疗中，单克隆抗体可以用于靶向治疗癌症、自身免疫疾病和传染病等。在生物学研究中，单克隆抗体广泛应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等实验技术中。总结：

单克隆抗体制备

单克隆抗体制备 1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。每次免疫使用50-100µg免疫原。 4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/8的免疫原。接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。 5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。第4星期

溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。 6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。 7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。 8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。

小鼠单克隆抗体的制备

小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。 1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。 2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。 3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。 5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。

(整理)单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术-------------

使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：二、基本方法 -------------

单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤 1.抗原选择：首先，选择需要制备单克隆抗体的目标抗原。这个抗原可以是来自于生物体的蛋白质、多肽、糖或其他小分子。 2.免疫动物选择：根据抗原的种类选择适当的动物进行免疫。一般常用的动物包括小鼠、大鼠和兔子。 3.免疫接种：将选定的抗原注射到免疫动物体内，激发其产生抗体。在接种前，可以根据需要选择适当的免疫佐剂来增强免疫效果。 4.血清采集：在免疫动物产生了充分的免疫应答后，采集免疫动物的血清。 5.B细胞获取：从免疫动物的脾脏或骨髓中获取B细胞，这些细胞可以产生特定的抗体。 6.融合细胞生成：将B细胞与骨髓瘤细胞（如鼠骨髓瘤细胞NS1或人骨髓瘤细胞SP2/0）用聚乙二醇等化学物质或电穿孔法进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。 7.杂交瘤筛选：通过增殖选择方法（如HAT培养基）对细胞进行筛选，筛选出具有产生抗体能力的杂交瘤细胞。 8.单克隆细胞扩增：选出抗体阳性的培养皿（通常是96孔板）中的单克隆细胞，继续进行扩增培养。 9.抗体检测：通过ELISA、免疫组化等方法检测细胞上所产生的抗体的特异性和亲和力。

10.抗体纯化：对单克隆抗体进行纯化，可借助离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术。这些技术可以去除与抗体无关的其他蛋白质或污染物。 11. 抗体鉴定：对纯化的抗体进行进一步的检测和鉴定，包括亲和力测定、特异性检验、Western blot等。 12.抗体应用：经过鉴定合格的单克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀等多种分子生物学和生物医学研究领域。需要注意的是，单克隆抗体的研制是一项技术较为复杂和专业化的工作，需要科研人员具备一定的实验技术和经验。同时，不同抗原和动物的特点也需要在实验设计时进行充分的考虑。

单克隆抗体的制作流程

单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作 1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。 2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。 3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。 4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。二、免疫过程 1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。 2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。 3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。三、杂交细胞制备 1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。 2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。 3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。 4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克

隆抗体的杂交瘤。四、单克隆抗体制备 1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。 2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。 3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。 4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。五、应用 1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。 2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。 3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。步骤一：抗原免疫 1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。 2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。 3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。步骤二：细胞融合 1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。 2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。 3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。将其培养至对数生长期。 4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。步骤三：细胞筛选与扩展

1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。 2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。 3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。步骤四：单克隆抗体鉴定 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。 2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。 3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。步骤五：单克隆抗体生产与纯化 1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。 2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。 3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。 4.保存与贮存：将纯化的单克隆抗体通过冻干或低温保存，保证其稳定性和长期使用。注意事项： 1.在制备单克隆抗体过程中，应遵守相关的伦理规定和实验操作准则。

单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓

单克隆抗体的主要制备步骤

单克隆抗体的主要制备步骤 (1) 抗原选择选择可以诱导单克隆抗体产生的抗原，这取决于抗体用途，一般有以下方式：从一组表位图谱型不同但都具有类似化学行为的多肽残基中选择抗原，根据具体抗体功能要求考虑氨基酸的类型、结构特征和数量，或从一种蛋白质或复合物中选择抗原。 (2) 抗原纯化一般采用分离技术如凝胶纯化，毛细过滤，液体比表面张力分选等对抗原进行纯化，从有机溶剂或皂-甘油系统中抽提出目标抗原。 (3) 抗原药物化抗原药物化是指给抗原结构中添加有活性的氨基酸残基l以便于有助于抗体分泌和诱导单克隆抗体的分泌。 (4) 动物免疫使用符合动物禁忌的抗原对动物接种，一般使用的动物有小鼠、大鼠、兔等，一般先对动物预先接种弱毒的另一抗原，然后在鼠脑灰质接种有效抗原，以进行免疫，天然抗体的分泌可以被记录下来，以观测动物不同时期分泌抗体的曲线，以选择最佳免疫时期，并在该时期给动物加强免疫。 (5) 筛选抗体储备从免疫动物(通常以小鼠为主)未血液提取后利用ELISA法或免疫沉淀法筛选抗体，可以获得更加特异性的抗体。下一步，提取血清中的抗体，以制备抗体芯片。 (6) 单克隆抗体制备为了确定抗体的应用能力和产量，克隆抗体是需要利用特殊的抗原进行克隆的。抗体芯片的每个克隆可以从细胞培养液、血清中分离出来，再进行分离纯化处理，最终得到每个克隆的单克隆抗体。 (7) 纯化单克隆抗体用不同配体结合离子交换树脂、蛋白质A树脂、蛋白G树脂等专用色谱柱和作用，也可以在水溶性溶剂中进行纯化部分的单克隆抗体，以使抗体分子的结构稳定。 (8) 单克隆抗体表征一般可以采用聚合物链断裂、等电点、半衰期、激活热程序分析（SEC-HPLC）等技术对单克隆抗体的特性进行表征，用于检测产品鉴定和产品质量保证。

高中生物《单克隆抗体的制备》

高中生物《单克隆抗体的制备》单克隆抗体是一种专一性极强的抗体，是由一种单一的淋巴细胞或细胞群体产生的，仅能特异性的识别和结合一种抗原。在医学、生物科学、免疫学等领域中得到了广泛的应用。本文将介绍单克隆抗体的制备方法。单克隆抗体制备方法：一、免疫原制备制备单克隆抗体的关键是选取质量优良的免疫原，一般来说，免疫原应是纯化、特异性强和含有多个抗原表位的物质。二、小鼠免疫将经充分清洗的免疫原，加入无菌纯水中混合悬浮后，与适量的氢氧化铝混合，制成疫苗。将经过筛选的小鼠作为进行免疫的实验动物，并用疫苗进行免疫，使小鼠产生多克隆抗体。免疫期一般在5-8周之间，不宜过短或过长，以免影响产生的抗体的质量。三、脾细胞制备在小鼠免疫期结束后，将小鼠的脾脏取出，用PBS缓冲液冲洗，得到脾细胞。脾细胞是制备单克隆抗体时的重要材料，需要在取出脾脏后尽快处理，以保证细胞数量和活性的充足。四、瘤细胞融合将脾细胞与瘤细胞进行混合，经过某些药物的刺激，使两种细胞融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的特点是生长速度快，细胞寿命长，抗体分泌能力强，是单克隆抗体的制备过程中不可或缺的一环。五、分选单克隆细胞将杂交瘤细胞进行分离和筛选，筛选出能够产生特异性单克隆抗体的细胞。六、培养细胞产生抗体将分选出来的单克隆细胞培养在含有特定物质的培养基中，经过数次分离和筛选，获取产生大量单克隆抗体的细胞系。七、提取单克隆抗体

将细胞培养物通过旋转离心等方法，将单克隆抗体从培养液中提取出来，并进行进一步的纯化和检测。对提取出来的单克隆抗体进行检测，包括其特异性、纯度、抗原特异性等指标的检测，确保单克隆抗体的质量。总结：单克隆抗体制备的流程繁琐，但制备出的单克隆抗体优异的特异性和高度的纯度，尤其在生物医学和免疫学领域中得到广泛的应用。

单克隆抗体的制备(详细材料)

单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物.即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成.因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗.由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体.通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产 monoclonal antibody）,简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖. 二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T）的培养基（HAT）中生长进行选择.在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT—骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本