单克隆抗体的制备流程

（一）动物的选择与免疫

1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐

剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫1×107/0.5ml ip

↓3周后

加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

↓

取脾融合

（二）细胞融合

1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择：

骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb 的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml ↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37℃CO2孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗一次

↓

脾脏研碎，过细胞筛

↓

离心，细胞用培养液洗2次

↓

计数

↓

取108脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

↓

用无血清培养液洗2次

↓

计数，取得×107细胞备用

（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性

抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

2．抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

（四）杂交瘤的克隆化

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法

1．有限稀释法克隆

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏

1．杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。

2．细胞复苏方法

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

（六）单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射

0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。

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单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射) ↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip ↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合

2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射 │(一般～1ml ／点) ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过 ↓3周后

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。注意事项：

➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

单克隆抗体的制备过程

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。制备过程 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融

合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备

小鼠单克隆抗体的制备

小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。 1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。 2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。 3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。 5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。

制备单克隆抗体的原理

制备单克隆抗体的原理单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。制备单克隆抗体的过程可以分为四个步骤：免疫、细胞融合、筛选和扩增。第一步是免疫。在这一步中，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，以刺激其免疫系统产生抗体。这些抗体会被B细胞产生并分泌到血液中。第二步是细胞融合。在这一步中，从免疫小鼠的脾脏中收集B细胞，并与一种特殊的癌细胞（称为骨髓瘤细胞）融合。这种融合产生的细胞称为杂交瘤细胞，它们具有两种细胞的特性：B细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。第三步是筛选。在这一步中，杂交瘤细胞被分配到96孔板中，每个孔中只有一个细胞。然后，每个孔中的细胞被检测其是否产生特定的抗体。这种检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色法。只有产生特定抗体的细胞才会被保留下来。第四步是扩增。在这一步中，产生特定抗体的杂交瘤细胞被扩增，

以获得足够的单克隆抗体。这些抗体可以通过培养杂交瘤细胞或通过收集细胞培养液来获得。制备单克隆抗体的原理是利用B细胞的特异性和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，通过细胞融合和筛选，获得同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。单克隆抗体的应用非常广泛。它们可以用于诊断、治疗和研究。例如，单克隆抗体可以用于检测病原体、肿瘤标志物和药物残留物。它们还可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。此外，单克隆抗体还可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发新的生物技术产品。制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。

人单克隆抗体制备

人单克隆抗体制备一、引言人单克隆抗体是由一种单一的免疫细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。与传统的多克隆抗体相比，人单克隆抗体具有更好的一致性和稳定性，因此在医学研究和临床应用中具有重要意义。二、制备方法人单克隆抗体的制备可以通过以下步骤完成： 1. 免疫原选择：选择与目标疾病相关的适当免疫原，如病毒、细菌、肿瘤抗原等。 2. 免疫动物免疫：将免疫原注射到合适的动物体内，如小鼠、大鼠等，以激发免疫反应。 3. 混合细胞免疫：从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，与骨髓细胞融合，形成杂交瘤细胞。 4. 杂交瘤细胞筛选：使用选择性培养基筛选出能够产生目标抗体的杂交瘤细胞。 5. 单克隆细胞扩增：将合适的杂交瘤细胞注射到小鼠或裸鼠体内，获得单个克隆的杂交瘤细胞。 6. 抗体表达和纯化：将单克隆细胞培养并收集上清液，通过亲和层

析、离子交换层析等技术纯化目标抗体。三、应用领域人单克隆抗体在医学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面： 1. 治疗：人单克隆抗体可以用于治疗各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病等。通过与靶标分子结合，抑制病理过程或刺激免疫系统，达到治疗效果。 2. 诊断：人单克隆抗体可以作为诊断试剂，用于检测疾病的标志物或特定分子。例如，通过检测血清中的特定抗体可以判断是否感染某种病原体。 3. 研究工具：人单克隆抗体可以作为研究工具，用于研究特定分子的功能、相互作用等。例如，可以使用单克隆抗体来检测蛋白质在细胞中的定位和表达水平。 4. 药物研发：人单克隆抗体也可以作为药物研发的载体。通过将药物结合到抗体上，可以提高药物的靶向性和稳定性，减少副作用。四、发展前景人单克隆抗体制备技术的不断发展，为医学研究和临床治疗带来了巨大的机遇。随着基因工程和生物技术的进步，越来越多的人单克隆抗体将被制备出来，并在各个领域得到广泛应用。

单克隆抗体的制作流程

单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作 1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。 2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。 3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。 4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。二、免疫过程 1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。 2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。 3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。三、杂交细胞制备 1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。 2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。 3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。 4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克

隆抗体的杂交瘤。四、单克隆抗体制备 1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。 2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。 3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。 4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。五、应用 1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。 2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。 3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到

单克隆抗体纯化过程

单克隆抗体纯化过程引言单克隆抗体是一种高度特异性的蛋白质，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。单克隆抗体的纯化是制备高纯度、高活性的单克隆抗体的关键步骤之一。本文将详细介绍单克隆抗体纯化过程及其相关技术。单克隆抗体纯化过程 1. 细胞培养与收获单克隆抗体的制备首先需要进行细胞培养。通常使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）作为表达宿主，将表达目标单克隆抗体的重链和轻链基因转染到CHO细胞中。经过适当的培养条件，使得CHO细胞表达目标单克隆抗体。当细胞达到一定密度后，可以进行收获。收获过程中，需要将培养基与细胞分离，并将细胞沉淀下来。常用的方法有离心和滤液等。 2. 细胞破碎与抗体提取收获的细胞需要进行破碎，以释放细胞内的抗体。细胞破碎可以通过超声波、高压均质器、刀式破碎机等方法实现。破碎后的细胞溶液中含有目标单克隆抗体、细胞碎片和其他杂质。为了提取目标单克隆抗体，需要进行固液分离。常用的方法有离心和滤液等。离心可以将细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，而滤液可以去除较小颗粒的杂质。 3. 亲和层析亲和层析是单克隆抗体纯化过程中最常用的方法之一。通过利用抗体与特定配体（如蛋白A或蛋白G）之间的特异性结合，将目标单克隆抗体选择性地吸附到固定在亲和树脂上的配体上。亲和层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将亲和树脂与缓冲液进行平衡，以确保树脂处于最佳状态。 - 样品加载：将含有目标单克隆抗体的样品加入亲和树脂中，使得抗体与配体结合。 - 洗脱：使用特定的洗脱缓冲液，将非特异性结合的杂质洗脱，保留目标单克隆抗体。 - 再生：通过使用再生缓冲液，将目标单克隆抗体从亲和树脂上解离下来，以便进行下一轮层析。

单克隆抗体的制备技术

单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。 1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。免疫原的选择基于所需抗体的特异性。一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。 2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。 3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。

4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。 5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。 6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。这些测试可以验证抗体的特异性和效能。总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。通过对这些杂交瘤细胞的筛选和分离，可以建立纯化的单个细胞克隆，这些克隆细胞会持续产生与特定免疫原结合的特异性抗体。这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等多个领域。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。步骤一：抗原免疫 1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。 2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。 3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。步骤二：细胞融合 1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。 2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。 3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。将其培养至对数生长期。 4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。步骤三：细胞筛选与扩展

1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。 2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。 3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。步骤四：单克隆抗体鉴定 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。 2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。 3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。步骤五：单克隆抗体生产与纯化 1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。 2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。 3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。 4.保存与贮存：将纯化的单克隆抗体通过冻干或低温保存，保证其稳定性和长期使用。注意事项： 1.在制备单克隆抗体过程中，应遵守相关的伦理规定和实验操作准则。

单克隆抗体研制的详细步骤

单克隆抗体研制的详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。因为常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来很多麻烦。所以，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这个目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不但带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促动了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞实行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长实行选择。在融合后的细胞群体里，即使未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体得制备流程（一）动物得选择与免疫 1。动物得选择纯种ＢALB ／C 小鼠，较温顺，离窝得活动范围小,体弱，食量及排污较小,一般环境洁净得实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术得实验室多选用纯种ＢALA/ Ｃ小鼠。 2．免疫方案选择合适得免疫方案对于细胞融合杂交得成功,获得高质量得Mc Ａb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原得特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原１~５0μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0、8~1ml,0 、２mｌ／点） ↓３周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip （腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过0、5ml） ↓３周后第三次免疫剂量同一,不加佐剂,iｐ（5～7 天后采血测其效价） ↓2～3 周加强免疫,剂量50～５00μg为宜,ip 或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别就是一些弱抗原）得免疫方案也不断有所更新，如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原得免疫原性，另一方面可降低抗原得使用量。②改变抗原注入得途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体得免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原得反应性。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好得免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。初次免疫１ ×107/０、5ml ip ↓2～３周后第二次免疫1×1０７/0、5ｍl ｉｐ ↓3周后加强免疫（融合前三天）１ ×1０7/0、5ｍl ip 或iv ↓ 取脾融合（二）细胞融合 1.细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系得选择: 骨髓瘤细胞应与免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量M ｃAb. （2 ）饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散得细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖，所加入得这种细胞数被称为饲养细胞.在制备ＭcＡb得过程中, 许多环节需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化与扩大培养过程中，加入饲养细胞就是十分必要得。常用得饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程（一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合（二）细胞融合 1．细胞融合前准备

单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术

使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：二、基本方法

1. 抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。 2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞应选择

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。

完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基 80ml 小牛血清 15-20ml HT或HAT培养基： HT培养基HAT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基 99ml 98ml HT贮存液 1ml 1ml A贮存液1ml 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。 ③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L）称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW 242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。 ④L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。 ⑤青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。 ⑥7.5% NaHCO 溶液 3 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装称取分析纯NaHCO 3 小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。 ⑦HEPES溶液（1mol/L）称取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。 ⑧8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。 ⑨50% PEG 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml 分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5% NaHCO 调PH至8.0，或购买Sigma 3 或Gibco公司现成产品。（5）24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。