单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体的概念和原理
免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。
（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：
二、基本方法
1. 抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。
2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞应选择
处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feeder cell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。
3. 细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml
培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。
4. 有限稀释法
筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
5. 单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注
射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。
6. 单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的
抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
三、操作流程
（一）脾细胞
1．材料
(1) 免疫过的血清抗体滴度高的BALB/c小鼠。
(2) 1640培养液
(3) 2.5％FCS－1640营养液
2．操作方法
(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓瘤细胞）。
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
重复⑹、⑺步骤。
(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
（二）骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：
①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；
②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；
③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；
④生长速度快，繁殖时间短。
目前常用的BALB/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP20）；
③P2—X？—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO
以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。
（三）饲养细胞
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬
细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（BALB/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。
2．操作方法
（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
（5）1 000r／min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。（四）融合细胞
1. 融合剂
细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。
不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞
毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。
2. 融合过程
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1>．试剂与材料
(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2) 1640培养液100ml。
(3) 完全1640液100ml。
(4) 2.5％FCS－1640液50ml。
(5) HAT培养液100ml。
50％PEG：取分子量4 000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
40孔塑料培养盘。
2>．操作方法
⑴准备好脾细胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5％FCS－1640液。
⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。
⑹加预热至40℃的50％PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。
⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。
⑻重复⑺一次。
⑼加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。
⑽重复⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。
⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。
⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。
⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以
10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
3.细胞融合的关键
1>．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
2>．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
四、杂交瘤细胞的保存
（一）保存
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：
1．材料
(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(2) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。
(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
放液氮罐气态部分（-70℃）15h。
(7) 转入液氮部分。
（二）复苏
1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
6．继续培养，换液，以至形成单层。
动物的选择与免疫
1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALB/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在
融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
↓3周后
第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
↓3周后
第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
↓2～3周
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒
化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip
↓2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
↓3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓
取脾融合
细胞融合
1．细胞融合前准备
（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。
表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程： 1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项 一、脾细胞的准备： 1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。无菌操作取出脾脏，置于盛有 5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。 2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。 3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。再以同样的方法洗涤离心一 次。 4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液 备用。 注意事项： ➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。 二、骨髓瘤细胞的准备： 1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。 2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。 3.制备细胞悬液，计活细胞数。 4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。 注意事项：
➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。 ➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。 ➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%。细胞的最大密度不得超过106个/mL。 ➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时。➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。 ➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。 三、细胞融合： 1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。 2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。 3.用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散。 4.将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL预热的50% PEG，缓慢滴入离心管内，30秒内加 完，边加边轻轻搅拌，作用1～5min。 5.沿管壁滴加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL，同时边滴加边轻轻转动离心管。 6.800r/min条件下离心5～10min，弃上清。 7.将沉淀细胞轻轻混悬于含有20%的小牛血清的HAT选择培养液中，使细胞重悬。切记不 能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法 单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是指由同一个B细胞克隆 株产生，针对同一个特定抗原结构的抗体分子。与多克隆抗体相比，单克 隆抗体具有高度的特异性和一致性，因此在医学、生物学和生物工程领域 有着广泛的应用。下面将介绍单克隆抗体的制备方法。 二、免疫与细胞融合 1.免疫：将特定抗原注射入小鼠体内，激活免疫系统产生抗体。通常 需要多次免疫来增强免疫应答。 2.细胞融合：将小鼠脾细胞（B细胞）与骨髓癌细胞进行细胞融合。 骨髓癌细胞具有不限制增殖的特性，可以保证融合后的细胞永生长。 三、细胞筛选与培养 1.筛选：将细胞混合溶液分装入多孔板，进行细胞浓度稀释，使每个 孔中只存在一个细胞。之后进行培养，使细胞形成单个克隆。 2.培养：将筛选出的细胞转移到含有胎牛血清的培养基中，维持细胞 生长。根据细胞克隆的特性，可以采用悬浮培养或贴壁培养的方式。 四、抗体分离与鉴定 1.抗体分离：将培养基收集，离心沉淀，得到抗体含量较高的上清液。 2. 抗体鉴定：进行免疫学方法的检测，例如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫印迹（Western blot）。通过对不同抗原的反应特异性和亲和力进行检测，确定具有特殊 功能的单克隆抗体。
五、扩充与保存 1.规模扩大：将具有特异性、亲和力较高的单克隆抗体细胞进行大规 模培养，获得大量的抗体。 2.冻存保存：使用液氮冷冻细胞保存技术，将单克隆抗体细胞冷冻保存，以备后续的使用和生产。 六、应用领域 单克隆抗体具有广泛的应用领域，包括医学诊断、疾病治疗和生物学 研究等。在医学诊断中，单克隆抗体可以用于检测肿瘤标志物、病原体和 药物残留物等。在疾病治疗中，单克隆抗体可以用于靶向治疗癌症、自身 免疫疾病和传染病等。在生物学研究中，单克隆抗体广泛应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等实验技术中。 总结：
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备 1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。每次免疫使用50-100µg免疫原。 4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/8的免疫原。接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。 5. 第0星期预采血 完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。 第2星期 完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。 第3星期 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。 第4星期
溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。 第5星期 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。 第X星期 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。 6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。 7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。 8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
小鼠单克隆抗体的制备
小鼠单克隆抗体的制备 小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。 1. 免疫小鼠 选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。 2. 制备小鼠脾细胞 将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。 3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。 4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞 可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。 5. 扩增单克隆细胞并提取抗体 将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。 小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。
(整理)单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体的概念和原理 免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。 （1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 （2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术-------------
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下： 二、基本方法 -------------
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项 单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分 离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。制备单克隆抗体的方法主要 有杂交瘤技术和重组DNA技术。以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。 步骤一：抗原免疫 1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合 适的抗原。 2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。选择适合的动物后，根据 抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。 3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。通常 先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。 步骤二：细胞融合 1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。 2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培 养基中培养，以供细胞融合使用。 3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。 将其培养至对数生长期。 4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。 步骤三：细胞筛选与扩展
1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择 杂交瘤细胞。 2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行 有限稀释，使其实现单克隆化。 3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。 步骤四：单克隆抗体鉴定 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株， 检测其抗原特异性。 2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其 在特定细胞或组织中的反应。 3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志 物的结合情况。 步骤五：单克隆抗体生产与纯化 1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。 2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。 3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体 进行纯化和浓缩。 4.保存与贮存：将纯化的单克隆抗体通过冻干或低温保存，保证其稳 定性和长期使用。 注意事项： 1.在制备单克隆抗体过程中，应遵守相关的伦理规定和实验操作准则。
高中生物《单克隆抗体的制备》
高中生物《单克隆抗体的制备》 单克隆抗体是一种专一性极强的抗体，是由一种单一的淋巴细胞或细胞群体产生的，仅能特异性的识别和结合一种抗原。在医学、生物科学、免疫学等领域中得到了广泛的应用。本文将介绍单克隆抗体的制备方法。 单克隆抗体制备方法： 一、免疫原制备 制备单克隆抗体的关键是选取质量优良的免疫原，一般来说，免疫原应是纯化、特异性强和含有多个抗原表位的物质。 二、小鼠免疫 将经充分清洗的免疫原，加入无菌纯水中混合悬浮后，与适量的氢氧化铝混合，制成疫苗。将经过筛选的小鼠作为进行免疫的实验动物，并用疫苗进行免疫，使小鼠产生多克隆抗体。免疫期一般在5-8周之间，不宜过短或过长，以免影响产生的抗体的质量。 三、脾细胞制备 在小鼠免疫期结束后，将小鼠的脾脏取出，用PBS缓冲液冲洗，得到脾细胞。脾细胞是制备单克隆抗体时的重要材料，需要在取出脾脏后尽快处理，以保证细胞数量和活性的充足。 四、瘤细胞融合 将脾细胞与瘤细胞进行混合，经过某些药物的刺激，使两种细胞融合成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的特点是生长速度快，细胞寿命长，抗体分泌能力强，是单克隆抗体的制备过程中不可或缺的一环。 五、分选单克隆细胞 将杂交瘤细胞进行分离和筛选，筛选出能够产生特异性单克隆抗体的细胞。 六、培养细胞产生抗体 将分选出来的单克隆细胞培养在含有特定物质的培养基中，经过数次分离和筛选，获取产生大量单克隆抗体的细胞系。 七、提取单克隆抗体
将细胞培养物通过旋转离心等方法，将单克隆抗体从培养液中提取出来，并进行进一 步的纯化和检测。 对提取出来的单克隆抗体进行检测，包括其特异性、纯度、抗原特异性等指标的检测，确保单克隆抗体的质量。 总结： 单克隆抗体制备的流程繁琐，但制备出的单克隆抗体优异的特异性和高度的纯度，尤 其在生物医学和免疫学领域中得到广泛的应用。
单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤 1.抗原选择：首先，选择需要制备单克隆抗体的目标抗原。这个抗原 可以是来自于生物体的蛋白质、多肽、糖或其他小分子。 2.免疫动物选择：根据抗原的种类选择适当的动物进行免疫。一般常 用的动物包括小鼠、大鼠和兔子。 3.免疫接种：将选定的抗原注射到免疫动物体内，激发其产生抗体。 在接种前，可以根据需要选择适当的免疫佐剂来增强免疫效果。 4.血清采集：在免疫动物产生了充分的免疫应答后，采集免疫动物的 血清。 5.B细胞获取：从免疫动物的脾脏或骨髓中获取B细胞，这些细胞可 以产生特定的抗体。 6.融合细胞生成：将B细胞与骨髓瘤细胞（如鼠骨髓瘤细胞NS1或人 骨髓瘤细胞SP2/0）用聚乙二醇等化学物质或电穿孔法进行细胞融合，形 成杂交瘤细胞。 7.杂交瘤筛选：通过增殖选择方法（如HAT培养基）对细胞进行筛选，筛选出具有产生抗体能力的杂交瘤细胞。 8.单克隆细胞扩增：选出抗体阳性的培养皿（通常是96孔板）中的 单克隆细胞，继续进行扩增培养。 9.抗体检测：通过ELISA、免疫组化等方法检测细胞上所产生的抗体 的特异性和亲和力。
10.抗体纯化：对单克隆抗体进行纯化，可借助离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术。这些技术可以去除与抗体无关的其他蛋白质或污染物。 11. 抗体鉴定：对纯化的抗体进行进一步的检测和鉴定，包括亲和力测定、特异性检验、Western blot等。 12.抗体应用：经过鉴定合格的单克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀等多种分子生物学和生物医学研究领域。 需要注意的是，单克隆抗体的研制是一项技术较为复杂和专业化的工作，需要科研人员具备一定的实验技术和经验。同时，不同抗原和动物的特点也需要在实验设计时进行充分的考虑。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程 一、前期准备工作 1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。 2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。 3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。 4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。 二、免疫过程 1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。 2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。 3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。 三、杂交细胞制备 1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。 2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。 3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。 4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克
隆抗体的杂交瘤。 四、单克隆抗体制备 1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。 2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲 和力。 3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多 的单克隆抗体。 4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进 行纯化，并进行质量鉴定。 五、应用 1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试 剂使用。 2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标 记或特异性结合试剂使用。 3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。 六、总结 单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。其中，前期准备工作和免疫过程是制 备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到
单克隆抗体的制备(详细材料)
单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物.即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成.因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗.由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体.通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产 monoclonal antibody）,简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖. 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T）的培养基（HAT）中生长进行选择.在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT—骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本
单克隆抗体的主要制备步骤
单克隆抗体的主要制备步骤 (1) 抗原选择 选择可以诱导单克隆抗体产生的抗原，这取决于抗体用途，一般有以下方式：从一组表位图谱型不同但都具有类似化学行为的多肽残基中选择抗原，根据具体抗体功能要求考虑氨基酸的类型、结构特征和数量，或从一种蛋白质或复合物中选择抗原。 (2) 抗原纯化 一般采用分离技术如凝胶纯化，毛细过滤，液体比表面张力分选等对抗原进行纯化，从有机溶剂或皂-甘油系统中抽提出目标抗原。 (3) 抗原药物化 抗原药物化是指给抗原结构中添加有活性的氨基酸残基l以便于有助于抗体分泌和诱导单克隆抗体的分泌。 (4) 动物免疫 使用符合动物禁忌的抗原对动物接种，一般使用的动物有小鼠、大鼠、兔等，一般先对动物预先接种弱毒的另一抗原，然后在鼠脑灰质接种有效抗原，以进行免疫，天然抗体的分泌可以被记录下来，以观测动物不同时期分泌抗体的曲线，以选择最佳免疫时期，并在该时期给动物加强免疫。 (5) 筛选抗体储备 从免疫动物(通常以小鼠为主)未血液提取后利用ELISA法或免疫沉淀法筛选抗体，可以获得更加特异性的抗体。下一步，提取血清中的抗体，以制备抗体芯片。 (6) 单克隆抗体制备 为了确定抗体的应用能力和产量，克隆抗体是需要利用特殊的抗原进行克隆的。抗体芯片的每个克隆可以从细胞培养液、血清中分离出来，再进行分离纯化处理，最终得到每个克隆的单克隆抗体。 (7) 纯化单克隆抗体 用不同配体结合离子交换树脂、蛋白质A树脂、蛋白G树脂等专用色谱柱和作用，也可以在水溶性溶剂中进行纯化部分的单克隆抗体，以使抗体分子的结构稳定。 (8) 单克隆抗体表征 一般可以采用聚合物链断裂、等电点、半衰期、激活热程序分析（SEC-HPLC）等技术对单克隆抗体的特性进行表征，用于检测产品鉴定和产品质量保证。